【摘 要】
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目的:靶向脂质代谢关键酶研发抗乳腺癌药物已经成为近年来乳腺癌药理学研究的热点。硬脂酰辅酶A去饱和酶1（stearoyl-CoA desaturase 1,SCD-1）是催化饱和脂肪酸（saturated fatty acid,SFA）生成单不饱和脂肪酸（monounsaturated fatty acid,MUFA）的关键酶,与乳腺癌的进展和预后密切相关,为乳腺癌潜在的治疗靶点。现有的SCD-1抑
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目的:靶向脂质代谢关键酶研发抗乳腺癌药物已经成为近年来乳腺癌药理学研究的热点。硬脂酰辅酶A去饱和酶1（stearoyl-CoA desaturase 1,SCD-1）是催化饱和脂肪酸（saturated fatty acid,SFA）生成单不饱和脂肪酸（monounsaturated fatty acid,MUFA）的关键酶,与乳腺癌的进展和预后密切相关,为乳腺癌潜在的治疗靶点。现有的SCD-1抑制剂如A939572、MF-438等因存在毒副作用比较大的问题都还处于临床前研究阶段。本研究的目的有:（1）从毒副作用较小的中草药活性成分淫羊藿素（icaritin,ICT）出发试图研发靶向SCD-1的药物;（2）检测该活性化合物对乳腺癌细胞的作用;（3）探究该作用的相关机制。方法:（1）通过计算机辅助药物设计（computer aided drug design,CADD）的方法模拟改造ICT基团,并与SCD-1进行分子对接,获得潜在的SCD-1抑制剂;ICT衍生物经实验室制备合成后,通过MTT检测对MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-231乳腺癌细胞的作用;通过蛋白免疫印迹和GC-MS分别检测IC2对MCF-7细胞中SCD-1的表达和酶活性作用;以及蛋白免疫印迹检测ICT衍生物对ERa蛋白表达的影响。（2）DAPI染色和LIVE/DEADTM死细胞染色检测不同浓度ICT衍生物处理后MCF-7细胞死亡情况;Ad-m Cherry-GFP-LC3B腺病毒转染细胞观察自噬进程,蛋白免疫印迹检测自噬标志物LC3B Ⅱ的表达和上游分子AMPK磷酸化水平;流式细胞仪检测细胞凋亡情况、ROS生成情况,JC-1染色检测线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,MMP）,蛋白免疫印迹检测凋亡相关蛋白;通过添加AMPK抑制剂以及自噬抑制剂,探索自噬与凋亡的关系以及MAPK家族在凋亡过程中的作用。（3）外源性添加SCD-1产物油酸（oleic acid,OA）观察细胞活性,油红O染色和BODIPY染色观察细胞内脂滴生成情况;NAO染色检测线粒体膜上心磷脂的变化情况;ATP试剂盒检测ICT衍生物对线粒体能量代谢的影响。结果:（1）CADD结果提示ICT衍生物IC1、IC2、IC3,具有优于ICT的SCD-1抑制作用,其中IC2与SCD-1的自由结合能最低,是潜在的SCD-1抑制剂;实验发现IC2剂量依赖性抑制三种乳腺癌细胞的增殖、SCD-1的表达以及酶活性,证实IC2为一种新型SCD-1抑制剂,具有抗乳腺癌作用;另外,低剂量IC2可轻微促进MCF-7细胞增殖,而20μM IC2可促进细胞死亡,并伴随ERa表达的降低。（2）DAPI染色以及死细胞染色结果发现高浓度IC2显著促进了细胞死亡;细胞自噬和凋亡水平升高,伴随LC3B Ⅱ表达以及AMPK磷酸化水平升高,活化PARP并下调Bcl-2的表达,降低MMP,产生大量ROS;添加AMPK抑制剂以及自噬抑制剂可调节细胞自噬和凋亡,同时影响MAPK家族P38、ERK、JNK磷酸化水平。（3）外源性添加OA可缓解IC2对细胞活性的抑制作用,并促进细胞内脂滴生成,但不影响线粒体膜心磷脂的含量,也不抑制ATP的生成,反而在20μM处促进ATP生成。结论:（1）IC2是一种新型SCD-1抑制剂,可抑制MCF-7、SK-BR-3、MDAMB-231细胞增殖。（2）IC2激活AMPK诱导MCF-7细胞发生自噬,同时诱导细胞发生线粒体依赖性凋亡;AMPK调控IC2处理时自噬与凋亡水平,MAPK家族在该凋亡过程中起着重要作用。（3）IC2通过抑制SCD-1减少单不饱和脂肪酸生成发挥抗肿瘤作用。
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