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中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)又称河蟹、毛蟹，是我国重要的水产经济动物，市场需求量极大，但是随着其养殖规模不断扩大，集约化程度不断提高，病毒、细菌、寄生虫等病原体大量繁殖，各种病害频发，严重影响河蟹养殖业的健康发展，使养殖户遭受了巨大的经济损失。中华绒螯蟹“颤抖病”是河蟹养殖中最常见且最严重的疾病，引起该病的是一种新型水产病原微生物中华绒螯蟹螺原体（Spiroplasmaeriocheiris）。本课题组前期研究证实，螺原体主要通过河蟹的鳃或体表进入体内，并首先侵染其靶细胞—血淋巴细胞，在其细胞内大量繁殖后随着血淋巴液循环而侵染包括肝脏、心脏、消化道、鳃、肌肉、神经等器官的结缔组织中，引起河蟹感染前期的无力、不食，后期由于神经组织中的病原大量侵染而引起河蟹附肢的颤抖，最终导致死亡。因此，探究螺原体侵染时，河蟹血淋巴细胞产生免疫反应的机制，对降低该病菌对河蟹养殖业的危害有着深远的意义。本课题组前期利用iTraq技术筛选了螺原体侵染前后河蟹血淋巴细胞中差异表达的蛋白，并挑选了两种重要的蛋白Rab7(EsRab7)和14-3-3Ζ(Es14-3-3Ζ)做了初步研究，证实它们参与到了螺原体侵染的过程中，本文在此基础上对这两个蛋白的功能做了进一步的研究，包括筛选靶向互作microRNA，在细胞水平上开展RNA干扰和重组蛋白过表达实验验证其免疫功能，具体研究内容从以下三个方面来开展：
1.中华绒螯蟹EsRab7和Es14-3-3Ζ相互作用microRNA的鉴定及功能研究
螺原体刺激后，河蟹血淋巴细胞中EsRab7的转录水平在6h开始显著上调并持续至24h，Es14-3-3Ζ的蛋白表达量在12h和24h均显著上调，证实这两种蛋白参与到了螺原体侵染的过程中。进而双荧光素酶报告基因检测筛选得到两种能够分别靶向作用于EsRab7和Es14-3-3Ζ基因的microRNA:miR-131-3p和miR-2309，证实了它们能够分别沉默EsRab7和Es14-3-3Ζ基因，并检测了它们在河蟹各组织中的分布情况，结果显示，两者在肝胰腺中的表达均最高，其次为神经，并且在血淋巴中也有表达。在个体上用螺原体刺激河蟹后，检测了10d内各时间点miR-131-3p和miR-2309在血淋巴和神经中的表达谱，结果显示在2-6d，两者在血淋巴中均呈现显著下调的趋势，而在神经中，两者均在4d开始显著下调并一直持续到10d。以上结果说明河蟹被螺原体侵染后，miR-131-3p与EsRab7基因、miR-2309与Es14-3-3Ζ基因之间的调控关系在其免疫过程中发挥着重要的作用。
2.中华绒螯蟹Rab7蛋白在螺原体入侵过程中的免疫功能研究
利用化学合成的miR-131-3p成功干扰了河蟹血淋巴细胞中EsRab7基因，并在螺原体刺激24h后，检测了细胞形态和活力、抗菌肽表达、螺原体拷贝数等指标，结果显示，EsRab7沉默组的细胞死亡最多，细胞活力和抗菌肽EsALF1、EsALF2和EsALF3的表达显著低于对照组和inhibitor组，螺原体拷贝数显著高于对照组和inhibitor组。在果蝇S2细胞中过表达了EsRab7-GFP蛋白并在螺原体刺激48h后，检测了细胞形态和活力、螺原体拷贝数等指标，结果显示，过表达组的细胞存活最多，细胞活力显著高于对照组，螺原体拷贝数显著低于对照组。以上结果说明miR-131-3p与EsRab7基因相互作用在螺原体的侵染过程中发挥着重要的作用。
3.中华绒螯蟹14-3-3Ζ蛋白在螺原体入侵过程中的免疫功能研究
利用化学合成的miR-2309成功干扰了河蟹血淋巴细胞中Es14-3-3Ζ基因，并在螺原体刺激24h后，检测了细胞形态和活力、免疫相关基因表达、螺原体拷贝数等指标，结果显示，Es14-3-3Ζ沉默组的细胞大批死亡，细胞活力、抗菌肽以及免疫相关基因Relish和ERK表达显著低于对照组和inhibitor组，EsRab7转录水平也随着Es14-3-3Ζ的变化而正相关改变，同时实验组螺原体拷贝数显著高于对照组和inhibitor组。利用过表达技术在果蝇S2细胞中过表达了Es14-3-3Ζ-GFP蛋白并加入螺原体刺激48h后，检测了细胞形态和活力、螺原体拷贝数等指标，结果显示，过表达组的细胞存活最多，细胞活力显著高于对照组，螺原体拷贝数显著低于对照组。以上结果说明miR-2309与Es14-3-3Ζ基因相互作用在螺原体的侵染过程中执行着重要的功能。
1.中华绒螯蟹EsRab7和Es14-3-3Ζ相互作用microRNA的鉴定及功能研究
螺原体刺激后，河蟹血淋巴细胞中EsRab7的转录水平在6h开始显著上调并持续至24h，Es14-3-3Ζ的蛋白表达量在12h和24h均显著上调，证实这两种蛋白参与到了螺原体侵染的过程中。进而双荧光素酶报告基因检测筛选得到两种能够分别靶向作用于EsRab7和Es14-3-3Ζ基因的microRNA:miR-131-3p和miR-2309，证实了它们能够分别沉默EsRab7和Es14-3-3Ζ基因，并检测了它们在河蟹各组织中的分布情况，结果显示，两者在肝胰腺中的表达均最高，其次为神经，并且在血淋巴中也有表达。在个体上用螺原体刺激河蟹后，检测了10d内各时间点miR-131-3p和miR-2309在血淋巴和神经中的表达谱，结果显示在2-6d，两者在血淋巴中均呈现显著下调的趋势，而在神经中，两者均在4d开始显著下调并一直持续到10d。以上结果说明河蟹被螺原体侵染后，miR-131-3p与EsRab7基因、miR-2309与Es14-3-3Ζ基因之间的调控关系在其免疫过程中发挥着重要的作用。
2.中华绒螯蟹Rab7蛋白在螺原体入侵过程中的免疫功能研究
利用化学合成的miR-131-3p成功干扰了河蟹血淋巴细胞中EsRab7基因，并在螺原体刺激24h后，检测了细胞形态和活力、抗菌肽表达、螺原体拷贝数等指标，结果显示，EsRab7沉默组的细胞死亡最多，细胞活力和抗菌肽EsALF1、EsALF2和EsALF3的表达显著低于对照组和inhibitor组，螺原体拷贝数显著高于对照组和inhibitor组。在果蝇S2细胞中过表达了EsRab7-GFP蛋白并在螺原体刺激48h后，检测了细胞形态和活力、螺原体拷贝数等指标，结果显示，过表达组的细胞存活最多，细胞活力显著高于对照组，螺原体拷贝数显著低于对照组。以上结果说明miR-131-3p与EsRab7基因相互作用在螺原体的侵染过程中发挥着重要的作用。
3.中华绒螯蟹14-3-3Ζ蛋白在螺原体入侵过程中的免疫功能研究
利用化学合成的miR-2309成功干扰了河蟹血淋巴细胞中Es14-3-3Ζ基因，并在螺原体刺激24h后，检测了细胞形态和活力、免疫相关基因表达、螺原体拷贝数等指标，结果显示，Es14-3-3Ζ沉默组的细胞大批死亡，细胞活力、抗菌肽以及免疫相关基因Relish和ERK表达显著低于对照组和inhibitor组，EsRab7转录水平也随着Es14-3-3Ζ的变化而正相关改变，同时实验组螺原体拷贝数显著高于对照组和inhibitor组。利用过表达技术在果蝇S2细胞中过表达了Es14-3-3Ζ-GFP蛋白并加入螺原体刺激48h后，检测了细胞形态和活力、螺原体拷贝数等指标，结果显示，过表达组的细胞存活最多，细胞活力显著高于对照组，螺原体拷贝数显著低于对照组。以上结果说明miR-2309与Es14-3-3Ζ基因相互作用在螺原体的侵染过程中执行着重要的功能。