我国肝癌的发病率和死亡率在恶性肿瘤中均排第二位，占全球每年因肝癌死亡人数的53％。经过几十年的努力，肝癌研究上已取得很大进展，根治切除术后的十年生存率已提高到30％左右，但即使是根治性切除，5年内仍有60～70％的病人出现转移复发，肝癌病人总体5年生存率仍只在5％左右。因此，探索肝癌转移复发的机制，寻找有效的抑制途径，已成为进一步提高肝癌生存率的关键。越来越多的证据表明，肿瘤是一种干细胞疾病。研究显示，肿瘤组织中只有极少量致瘤性细胞亚群具有无限增生的潜能，且对化疗药物有抗性，在肿瘤中充当干细胞的角色，这部分细胞在启动肿瘤的发生和生长中起了决定性作用。以往肝癌复发和转移研究忽视了肿瘤干细胞的存在及其重要性，采用的治疗方法不能有效抑制肿瘤发生、转移／复发的根本原因—肿瘤干细胞。这可能是导致肝癌治疗失败、肿瘤复发的主要原因。侧群(Side Population，SP)细胞是指可将荧光染料Hoechst33342泵出细胞外，在一步法骨髓造血干细胞分选时分离出的弱荧光信号细胞群。这群细胞在总量上只占整个骨髓细胞的0.05％，但却富含造血重建细胞，即造血干细胞。SP细胞在人和小鼠的骨髓、骨骼肌、神经系统等处均有发现。最近的研究证实，人乳腺癌、肺癌、胶质母细胞瘤体外传代细胞系中也可分离出SP细胞。研究表明，这些SP细胞高表达转运蛋白ABCG2／BCRP1，并大多同时表达有相应肿瘤干细胞的标记分子。ABCG2／BCRP1定位于细胞膜，具有“泵”的功能，因此SP细胞可将许多细胞毒化疗药物排出细胞外，从而使肿瘤对化疗药物产生耐药性。接种免疫双缺陷品系的小鼠NOD／SCID后显示，SP细胞具有极强的成瘤能力。目前许多学者认为，在缺乏显著的干细胞分子标记的情况下，SP细胞可作为肿瘤干细胞鉴定的一种重要途径。本课题利用我所建立的高／低转移人肝癌细胞系MHCC97-H／L，研究人肝癌细胞株中是否存在SP细胞亚群，并在体内外鉴定其生物学特性，探讨肝癌SP细胞亚群与肝癌转移复发的关系，并在临床肝癌组织标本中进行初步验证。一、高／低转移人肝癌细胞株MHCC97-H／L中侧群细胞的分选本部分工作主要研究高／低转移人肝癌细胞株MHCC97-H／L中是否存在SP细胞，以及ABCG2转运蛋白和SP细胞表型的关系。1．MHCC97-H／L中SP细胞的流式细胞分选MHCC97-H／L细胞悬液加入Hoechst33342和PI，然后其中一组加入ABCG2转运蛋白的抑制剂维拉帕米，上流式细胞仪检测。结果显示，MHCC97-H／L细胞系中均存在SP细胞，MHCC97-H中的SP细胞的比例(4.88±0.66％)显著高于MHCC97-L中的比例(0.88±0.36％)。(P＜0.05)2．膜转运蛋白ABCG2与SP细胞表型的关系细胞免疫组化实验结果显示，ABCG2蛋白在SP细胞中表达阳性，显著高于非SP细胞中的表达(P＜0.05)；Western blotting实验结果显示，ABCG2蛋白在SP细胞中高表达，而在非SP细胞中低表达。进一步用RT-PCR检测ABCG2 mRNA表达情况，发现SP及非SP细胞中均存在ABCG2基因的表达，但SP细胞显著高于非SP细胞(P＜0.05)。二、人肝癌侧群细胞生物学功能鉴定本部分工作主要研究人肝癌细胞系中SP细胞的生物学特性，研究肝癌SP细胞是否具有肿瘤干细胞的特性。1．形态学特点倒置显微镜下观察发现SP细胞较非SP细胞体积小，电镜下发现SP细胞和非SP细胞在亚细胞结构上存在显著差异，表现为SP细胞的高尔基体、游离核糖体、线粒体及粗面内质网较非SP细胞显著减少。2．克隆形成实验将SP细胞和非SP细胞等量接种于平板上，结果表明SP细胞的集落形成率(28.6±3.8％)显著高于非SP细胞集落形成率(8.6±2.8％)(P＜0.05)。3．细胞增殖实验MTT法连续检测细胞增殖实验结果显示，SP细胞生长活力显著高于非SP细胞(P＜0.05)，SP细胞倍增时间为(32.1±0.3)小时，非SP细胞倍增时间为(48.2±0.2)小时。4．明胶酶谱检测金属基质酶MMP2和MMP9的分泌明胶酶谱实验检测结果显示，SP细胞的MMP2和MMP9活性均显著增加(P＜0.05)，而非SP细胞相对于正常对照细胞则无改变。5．体外侵袭实验检测细胞侵袭能力在无血清培养基中，非SP细胞侵袭能力显著高于SP细胞，分别为4.5±1.0／HP和16.5±3.0/HP，差异具有统计学意义(P＜0.05)。6．NOD／SCID小鼠皮下接种成瘤实验不同数量级的细胞移植到NOD／SCID小鼠皮下，对于分选前的细胞，需要1×10~6以上的细胞才能成瘤(3／6)，平均成瘤时间(24±0.20)d。SP细胞只需1×10~4个细胞即可成瘤(5／6)，平均成瘤时间(18±0.21)d。而1×10~6的非SP细胞6只小鼠都没有成瘤(0／6)。SP细胞的成瘤能力显著强于非SP细胞。7．MTT法检测化疗药对细胞生长活力的影响我们用MTT法检测SP细胞和非SP细胞对化疗药物5-FU的耐药性。结果显示，化疗药5-FU对非SP细胞的生长抑制明显，对SP细胞的生长抑制不明显，差异有统计学意义(P＜0.05)三、临床肝癌标本原代培养细胞中侧群细胞的检测我们这部分的工作主要是检测临床肝癌组织标本中原代培养的细胞中是否存在SP细胞，以及SP细胞的生长特性与病人临床表型的相关性。我们收集复旦大学附属中山医院肝癌研究所2007年2月至2007年3月手术切除肝癌标本20例，胶原酶法消化细胞，制成单细胞悬液，再按传统的方法进行Hoechst33342染色后流式细胞检测原代培养细胞中的SP细胞。结果显示，部分临床肝癌标本原代培养细胞中存在SP细胞，并且SP细胞可能与临床肝癌的恶性表型相关。结论1．人肝癌细胞株及临床肝癌组织中均存在SP细胞亚群；2．肝癌SP细胞具有高致瘤性、耐药性等肿瘤干细胞特性，并与肝癌转移潜能呈正相关；3．肝癌SP细胞可能在临床肝癌复发转移中起重要作用。潜在应用价值1．SP细胞和肝癌侵袭转移潜能相关，可能有助于理解肝癌的转移复发机制。2．SP表型可能是肝癌干细胞的分选标志，并可能成为肝癌复发转移早期诊断与治疗的特异性靶点。创新点首次揭示SP细胞和肝癌转移潜能相关，可能在临床肝癌复发转移中起重要作用。