目的：　　持续的乙型肝炎病毒（HBV）感染是导致慢性肝脏疾病发生的主要原因。慢性HBV感染的癌症病人在接受化学治疗的过程中比非肝炎病毒感染的病人更易发生肝功能失调。肝癌是一种死亡率很高的癌症，90％的肝癌患者都有慢性乙型肝炎病毒的感染。有研究表明肝癌伴有HBV感染的病人在用抗病毒预防治疗通过降低HBV负荷后，在化疗过程中发生重症肝炎的风险降低。顺铂是一种非常有效的抗癌化疗药物，被广泛的用于治疗多种癌症。尽管其有很强的抗癌活性，但在临床上，特别是对HBV相关肝癌患者，因为顺铂的副作用使其临床应用受到限制。因此探讨HBV感染增强化疗药物毒副作用机制对于在化疗过程中降低发生重症肝炎的风险具有重要意义。　　通过凋亡导致肝细胞死亡是急性肝炎和慢性肝炎中重要的病理特征。糖调节蛋白78（Grp78）是一种定位于内质网的分子伴侣，属于热休克蛋白70家族（HSP70s）。近年来研究证明，Grp78除了有分子伴侣的作用，还能够保护细胞在应激状态下抵抗凋亡，降低细胞和组织受到的损伤。我们课题组前期的研究表明Grp78可以保护NIT-1抵抗链脲霉素和细胞因子诱导的凋亡。在肝癌组织中由于血液供应的不足经常处于应激状态，缺氧、酸性环境和葡萄糖的缺乏导致Grp78高表达抵抗化疗药物引起的凋亡。因此我们推测，化疗过程中HBV感染的肝癌病人容易发生的肝细胞损伤可能与HBV调节Grp78表达相关。在HBV相关的肝癌周围组织血液供应基本正常，其Grp78的表达可能比癌组织低；此外，HBV的感染亦有可能下调癌症周围组织细胞GRP78的表达，使其对化疗药物的毒性作用更加敏感，导致大量肝细胞的凋亡坏死发生肝功能紊乱。基于此，本研究以稳定转染HBV的Hep2.215细胞作为慢性肝炎病毒感染的体外细胞模型，从mRNA和蛋白水平检测Grp78的表达情况，进一步探讨GRP78表达与细胞凋亡的关系及其机制，以及HBV对GRP78及炎性因子表达的调控作用，旨在揭示HBV感染增加细胞对化疗药物敏感性的机制，从而为临床HBV相关肝癌的药物治疗研究提供新的策略。　　方法：　　1.细胞培养　　人肝癌细胞系HepG2和持续稳定表达HBV的HepG2.215为华中科技大学同济医学院免疫学系保存，于含10％胎牛血清的DMEM培养基中，37℃、95％湿度、5％CO2细胞培养箱中常规培养；　　2.采用CCK-8检测在顺铂不同浓度下HepG2.215和HepG2存活率　　1×104 HepG2.215和HepG2在96孔板培养过夜，0～30μg/ml顺铂培养24 h，加入CCK-8检测试剂，37℃孵育1.5 h，450nm吸光度下检测吸光度值。　　3.Annexin V/PI染色检测细胞凋亡　　用10μg/ml顺铂处理HepG2.215和HepG2细胞，24h后收集细胞上清，用无EDTA的胰酶消化贴壁的细胞，用Annexin V/PI染色，采用流式细胞术检测细胞凋亡；　　4.实时荧光定量PCR　　用Trizol提取HepG2.215和HepG2细胞的总RNA，逆转录合成cDNA，采用HBcAg、HBcAg、Grp78以及各种炎性因子的引物，检测其在HepG2.215和HepG2中的表达。　　5.JetPRIME转染　　用JetPRIME转染pIRES2-EGFP及pIRES2-Grp78-EGFP真核表达质粒，检测Grp78的表达。转染Grp78 siRNA及对照siRNA沉默Grp78的表达。　　6.Western blot　　用细胞裂解液提取HepG2.215和HepG2细胞的总蛋白，检测 Grp78、活化的caspase-3及PARP的蛋白表达。　　7.免疫组织化学　　收集2010-2012年间华中科技大学附属同济医院肝脏外科HBV感染肝癌及非 HBV感染的肝癌组织标本，用EnVision/HRP检测病人标本中癌旁组织Grp78的表达。　　8.miRNA芯片及microRNA检测　　提取HepG2.215和 HepG2细胞的总microRNA，用芯片检测这两种细胞中microRNA的表达差异。对有表达差异的microRNA，采用microRNA逆转录试剂盒逆转录目的microRNA用荧光标探针法进一步验证。　　结果：　　1．细胞活性检测结果表明，在不同浓度的顺铂处理下，HepG2.215的存活率比HepG2低。　　2．Annexin V/PI染色细胞凋亡检测结果表明，在半数致死剂量的顺铂处理下，持续HBV复制的HepG2.215细胞更易发生凋亡，且证明其Grp78的表达降低，caspase-3及PARP的表达增加。　　3．通过转染pIRES2-Grp78-EGFP真核表达质粒，使持续HBV复制的HepG2.215细胞过表达Grp78，可降低 HepG2.215细胞的凋亡率，并且可降低caspase-3的活化和裂解的PARP的表达。　　4．通过转染Grp78 siRNA沉默Grp78的表达，可增加HepG2细胞的凋亡率，并且增加caspase-3的活化和裂解的PARP的表达。　　5．免疫组织化学证明，组织标本中HBV相关的癌旁肝组织中Grp78的表达低于非HBV感染的癌旁肝组织。　　6．Real-Time PCR检测结果表明，HBV持续的复制可增加促炎细胞因子IL-23、IL-6、HMGB1的表达，同时实验结果表明， HBV持续的复制可增加IL-10、TGFβ的表达。　　7．采用芯片检测HepG2和HepG2.215两种细胞中microRNA的表达，结果提示两种细胞中microRNA的表达存在差异，采用生物信息学分析表达差异microRNA的可能作用靶分子，对表达差异的microRNA采用microRNA逆转录试剂盒逆转录目的microRNA，进一步采用荧光标探针法证明靶向作用Grp78的microRNA表达增高。　　结论：　　本研究以稳定转染HBV的Hep2.215细胞作为慢性肝炎病毒感染的体外细胞模型，从mRNA和蛋白水平检测Grp78的表达情况，探讨了GRP78表达与细胞凋亡的关系及其机制，以及HBV对GRP78及炎性因子表达的调控作用，研究结果表明：①体外细胞模型证明HBV可以增加细胞对化疗药物的敏感性，持续的HBV复制能够抑制抗凋亡蛋白Grp78的表达，促进细胞凋亡；②Grp78的表达可通过影响Caspase-3和 PARP的活化增强细胞抵抗凋亡；③HBV持续复制使细胞对凋亡敏感的同时，亦可增加细胞因子IL-23、IL-6，以及HMGB1的表达，促进炎症的发生；④首次证明HBV能够上调细胞内靶向抑制Grp78的mRNA转录的miR-181a和mi-362的表达，推测可能通过降低Grp78的表达与减弱Grp78抗病毒的作用，从而增加病毒的复制和生存，提示该作用可能参与HBV逃逸抗病毒的机制。上述结果揭示了感染HBV的肝癌病人在化疗过程中更容易发生肝功能紊乱的可能分子靶标，其详细机制尚待进一步深入研究。