第一部分二甲双胍对膀胱癌T24细胞迁移侵袭及增殖能力的影响目的：观察二甲双胍对迁移侵袭及增殖能力的影响。方法：用浓度分别为1、2、4、8 uM的二甲双胍在体外培养平板的单层细胞上进行划痕实验,作用细胞6h及12h后,于各时间节点采集图像检测细胞迁移能力变化；用浓度分别为1、2、4、8 uM的二甲双胍分别加入膀胱癌T24单细胞悬液的Transwell侵袭小室的上室,于6h和12h取出小室,利用侵袭实验检测细胞侵袭能力的变化；通过MTT比色法,按空白组及1、2、4、8uM浓度的二甲双胍加药处理48h,分析细胞的增殖情况；通过MTT比色法,用空白组及4uM二甲双胍处理12h、24h、48h、72h,分析细胞的增殖情况。结果：迁移实验结果显示：6h及12h的划痕愈合率,二甲双胍各浓度组(1、2、4、8 uM)与空白组比较差异有统计学意义(P<0.05)；而且二甲双胍各浓度组间比较差异也有统计学意义(P<0.05)。体外侵袭实验结果显示：6h及12h的每个视野的细胞数,二甲双胍各浓度处理组(1、2、4、8 uM)与空白组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)；而且二甲双胍各浓度组间比较平均每个视野细胞数差异也有统计学意义MTT比色法结果显示：当二甲双胍以浓度1、2、4、8uM作用于细胞48h时,细胞活力与空白对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)；4uM与1、2uM浓度组比较细胞活力差异具有统计学意义(P<0.05),而对于4uM与8uM浓度组比较,两者细胞活力不具有统计学差异(P>00.05)。同时,MTT结果显示：当4uM二甲双胍作用细胞48h组与作用12、24h细胞组及空白对照组对比,细胞活力之间的差别具有统计学意义(P<0.05),而对于48h与72h组细胞活力来比较,其差异没有统计学意义(P>0.05)。结论：二甲双胍不但能够减弱膀胱癌细胞株T24的迁移及侵袭能力,并且能够抑制膀胱癌细胞株T24的增殖,而上述这种抑制呈一定的浓度及时间依赖性。二甲双胍作用浓度在4uM、作用时间在48h时可以作为较适宜的体外实验的工作浓度及工作时间第二部分二甲双胍对膀胱癌T24细胞增殖凋亡侵袭相关调控基因表达的影响目的：观察二甲双胍对膀胱癌T24细胞增殖凋亡相关调控基因表达的影响。方法：在不同浓度(1、2、4、8 uM)的二甲双胍作用于膀胱癌T24细胞48h后进行以下检测。通过Annexin V-FITC/PI双染和流式细胞仪(FCM)分析凋亡情况；使用Rt-PCR法分别检测T24细胞中增殖、凋亡相关调控基因cyclinD1、HIF-1、c-Myc、caspase8、caspase9,迁移、侵袭相关调控基因MMP-2、MMP-9的表达变化；Western blot检测细胞中增殖、凋亡相关调控蛋白cyclinD1、HIF-1、c-Myc、 caspase8、 caspase9及迁移、侵袭相关调控蛋白MMP-2、MMP-9的表达变化。结果：在特定工作时间(48h)下,当二甲双胍以不同浓度(1、2、4、8 uM)作用于膀胱癌细胞T24后以下的检测结果。Annexin V-FITC/PI双染和流式细胞仪(FCM)显示：细胞的细胞凋亡率与空白对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05),而对于4uM与8uM浓度组比较,两者细胞凋亡率不具有统计学差异(P>0.05)。Rt-PCR法结果显示：随着二甲双胍浓度的递增,cyclinD1、HIF-1、c-myc基因表达有逐渐降低的趋势,而caspase-8以及caspase-9基因表达随着药物浓度的增加而逐渐升高,除二甲双胍(1uM)浓度组之外,其余浓度组cyclinD1、 HIF-1、c-myc、caspase-8、caspase-9基因表达与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05),而对于二甲双胍(4uM)与二甲双胍(8uM)浓度组cyclinD1、HIF-1、c-myc、caspase-8、caspase-9基因表达变化差异不具有统计学意义(P>0.05)；对于与细胞迁移及侵袭相关的MMP-2、及MMP-9基因表达变化并不明显(P>0.05)。 Western blot检测结果显示：蛋白分子cyclinD1、HIF-1、c-Myc其表达随着二甲双胍的浓度增加逐渐降低,caspase-8、caspase-9蛋白表达却随着二甲双胍浓度增加逐渐升高,各蛋白表达与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05),而对于二甲双胍(4uM)与二甲双胍(8uM)浓度组cyclinD1、caspase-8、caspase-9基因表达变化差异不具有统计学意义(P＞0.05), MMP-2、MMP-9表达变化不明显,各组之间差异不具有统计学意义(P>0.05)。结论：在特定时间(48h)作用后,二甲双胍能够以浓度梯度促进膀胱癌细胞株T24凋亡,抑制其增殖及凋亡调控相关蛋白cyclinD1、 HIF-1、c-Myc表达,促进蛋白caspase8以及caspase9表达上调,但并不影响其迁移及侵袭相关调控蛋白MMP-2、MMP-9的表达,这些变化可能与二甲双胍引起的膀胱癌细胞AMPK或mTOR信号通路变化有关。第三部分二甲双胍在体外增强膀胱癌细胞T24及BIU-87对顺铂敏感性及其机制的研究目的：研究二甲双胍在体外增强膀胱癌细胞T24及BIU-87对顺铂敏感性及其机制。方法：在体外MTT法初步检测不同浓度的(0.125、0.25、0.5、1.0 uM)的顺铂分别处理膀胱癌T24与BIU-87细胞48h后,检测顺铂单药对膀胱癌细胞增殖能力的抑制。采用不同浓度(1、2、4、8uM)二甲双胍联合顺铂(0.5uM)作用于膀胱癌T24与BIU-87细胞48h后,通过MTT实验分析细胞的增殖情况。选取顺铂(0.5 uM)、二甲双胍(4uM)、顺铂(0.5 uM)联合二甲双胍(4 uM)分别作用T24与BIU-87细胞48h后,流式细胞术对比其细胞周期变化；用Western blot法检测并观察AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR蛋白表达变化；细胞免疫荧光检测p-mTOR蛋白在各处理组细胞中的表达。结果：MTT法结果显示：当顺铂浓度分别高于或等于0.5 uM处理膀胱癌T24及BIU-87细胞株48 h,与空白组细胞及浓度低于0.5uM各处理组细胞相比,细胞活力明显降低,其差异具有统计学意义(P<0.05),而对于两株细胞0.5uM及luM处理组比较,两者细胞活力差异不具有统计学意义(P>0.05),选择0.5uM顺铂作为后续实验工作浓度。MTT结果显示：当不同浓度二甲双胍(1、2、4、8 uM)分别与顺铂(0.5 uM)联合作用处理膀胱癌T24及BIU-87细胞株48 h后,与空白组相比,细胞活力明显降低,其差异具有统计学意义(P<0.05),对于两株细胞顺铂联合低浓度(1、2、4 uM)二甲双胍明显呈剂量依赖抑制细胞增殖,而对于顺铂联合高浓度(4、8 uM)二甲双胍作用细胞,细胞活力变化不具有统计学意义(P>0.05)。流式细胞术显示：与对照组及顺铂(0.5 uM)、二甲双胍(4 uM)单药处理组相比,二甲双胍(4 uM)和顺铂(0.5 uM)联合用药处理组能够显著抑制膀胱癌T24及BIU-87细胞株于sub-G1期(p＜0.05)。Western blot结果显示：联合处理组膀胱癌T24与BIU一87细胞中p-mTOR蛋白与单药处理组及对照组比较表达明显减少,其差异具有统计学意义(P<0.05),而AMPK、 p-AMPK、mTOR表达变化并不明显(P>0.05)。细胞免疫荧光实验显示：膀胱癌T24、BIU-87细胞的空白组、二甲双胍处理组、顺铂处理组、二甲双胍与顺铂联合处理组免疫荧光阳性细胞数比较差异具有统计学意义(P<0.05),顺铂+二甲双胍联合处理组阳性细胞数明显少于空白组及单药处理组(P<0.05)。结论：体外实验显示中低浓度的二甲双胍能显著提高顺铂抑制膀胱癌细胞增殖的能力,其很可能与对信号通路mTOR的抑制有关。第四部分二甲双胍增强帻铂霄捣瞅癌细胞T24源性课鼠移植瘤生长及血管形成抑制能力的体内研究目的：体内实验研究一定浓度的二甲双胍联合顺铂对膀胱癌细胞T24源性移植瘤生长及血管形成能力的影响。方法：构建T24细胞裸鼠移植瘤模型,采用一定浓度的顺铂(2mg/ Kg/4d)与二甲双胍(250mg/Kg/4d)单独或联合用药后观察其移植瘤生长变化,免疫组织化学法检测移植瘤血清VEGF浓度及增殖指标Ki-67及微血管密度指标CD34变化。结果：裸鼠移植瘤的体内药物实验表明：二甲双胍(2mg/Kg/4d)联合顺铂(250mg/Kg/4d)对移植瘤的体积及重量的增加能够起到明显的抑制作用,其与单药处理组及对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)；免疫组织化学结果显示：二甲双胍联合顺铂能够更明显减低裸鼠模型血清VEGF的浓度及移植瘤的Ki-67阳性细胞数及微血管密度(由CD34标识),其与对照组及单药处理组相比较,差异具有显著的统计学意义(P<0.05)。结论：在裸鼠移植瘤的体内药物实验中,二甲双胍也能显著增强顺铂对移植瘤的生长抑制和血管形成。