多烯紫杉醇(docetaxel, DTX)是一种新型的、结构与紫杉醇(paclitaxel)类似的半合成的紫杉烷类化合物,它的抑制微管蛋白解聚的能力较紫杉醇高很多。由于多烯紫杉醇可促进细胞形成不稳定的微管,从而干扰了细胞的有丝分裂,是一活性很高的抗肿瘤活性物质。近年来DTX被广泛应用于治疗实体瘤,特别是乳腺癌、宫颈癌、非小细胞肺癌。研究显示,DTX与蒽醌类等化疗药物联用治疗乳腺癌、胰腺癌、消化系统肿瘤,临床疗效比单独使用更显著。人血清白蛋白(Human serum albumin, HSA)是血浆中含量丰富、溶解度较高的功能蛋白之一,它在保持人体正常生命活动中起着十分重要的作用。研究显示它能与激素(如雌二醇)、蒽醌类抗肿瘤药(如阿霉素)、染料(如酚红、溴甲酚绿)、黄酮类物质(如白藜芦醇)、胆固醇、脂肪酸等多种内源及外源物质结合,所以对这些物质的代谢及药理作用有着重要的影响。人血红蛋白(Human hemoglobin, HHb)是脊椎动物的血红细胞中所含丰富的一类运输蛋白。研究显示除了作为氧气的储库和载体外,人血红蛋白还可与很多内源和外源性小分子物质可逆结合,如一些药物、激素、胆红素、杀虫剂、杂环大分子、染料、黄酮类化合物等。本文采取多种光学方法,配合计算机分子对接辅助技术,系统研究了DTX对血浆中主要蛋白的作用机制,同时对该药物对不同肿瘤细胞系的抗肿瘤活性作比较,为今后药物体内的运输机制、毒性的研究提供一定的理论依据。另外针对药物溶解度问题造成的临床毒副作用,采取新的辅料和药物包合技术,对制备工艺条件及结构确证开展了系统研究,为新的药物制剂的开发奠定基础。1.利用光谱方法研究DTX与HSA相互作用采用紫外、荧光猝灭、同步荧光、傅里叶红外光谱、圆二色光谱技术对DTX与HSA相互作用进行研究,结果显示：HSA与DTX只有一个作用位点,DTX是蛋白内源性荧光的猝灭剂,而且猝灭的过程是一静态猝灭过程。热力学分析说明DTX与HSA相互作用是一自发的,放热过程,△H、△S分别是-41.07KJmol-1和-49.72Jmol-1K-1。因此在二者的作用及形成稳定复合物中氢键起了非常重要的作用。另外在研究中使用荧光探针——8-苯胺基-1-萘磺酸(8-Anilion-1-naphthalenesulfonic acid, ANS),结果说明：DTX结合在HSA的疏水空腔内并与ANS有相同的结合位点,这与光谱研究分析结果一致。傅里叶红外光谱、圆二色光谱、同步荧光数据均显示在DTX与HSA作用中改变了蛋白的二级结构,作用后的蛋白α-螺旋含量升高,DTX对Trp周围环境影响较Tyr大。通过Forster非辐射能量转移研究药物与蛋白结合距离大约为4.72nm,因此非辐射能量转移也可造成蛋白荧光的猝灭但不是主要原因。通过不同pH对DTX与HSA相互作用研究显示：pH升高不利于二者之间的作用。分子对接结果显示在DTX作用在结合位点I上,药物与蛋白之间存在多个氢键,这与光学研究结果一致。2.利用光谱方法研究DTX与HHb相互作用通过利用紫外、荧光猝灭、同步荧光、傅里叶红外光谱、圆二色光谱技术开展了DTX与HHb相互作用研究。研究结果表明DTX同样也是HHb内源荧光的猝灭剂,猝灭的过程与HSA不同,为一动态猝灭过程,它的Stern-Volmer猝灭常数随温度升高而升高,大小与HSA相近。在DTX与HHb之间存在一个结合位点,分子对接结果显示该位点存在于HHb中央空穴偏α1亚基上。热力学研究结果显示了该反应是一自发吸热过程,△H、△S均为正值,分别是9.18 KJmol-1和0.116 Jmol-1 K-1。疏水作用是二者之间的关键作用力,这与DTX和HSA研究结果不同。同样利用光谱学方法研究发现,蛋白由于药物的作用引起了其二级结构的改变。但与对HSA不同,HHb在作用后α-螺旋含量降低。Forster非辐射能量转移研究显示药物与蛋白结合距离大约为3.77nm。分子对接结果显示：①在距离DTX 5 A范围内DTX与多个氨基酸残基形成疏水作用；②DTX周围存在的β-Trp37为荧光猝灭结果奠定了结构基础；③DTX与HHb之间存在的多个氢键,氢键的作用象“锚”一样固定DTX,有利于药物与蛋白的疏水作用,这些结果进一步证实了光学的实验结果。3.DTX羟丙基-β-环糊精包合物的制备研究环糊精(Cyclodextrin, CD)是一种水溶性、非还原性环状低聚糖,常见的环糊精是由α-CD、β-CD、γ-CD,它们分别是由6、7、8个吡喃葡萄糖通过1,4-糖苷键连接构成。CD分子内部是一疏水空腔,外壁为亲水性的,能与多种物质形成超分子体系。现在CD已被广泛应用到化工、医药、化合物拆分及模拟酶等领域。由于CD水溶性较差,安全性较低,因此不能用于注射制剂。羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)是β-CD中的烷基衍生物,它的水溶性较β-CD显著提高增加(>500g/L,20℃),而且不参与生物体内代谢,也不蓄积,注射给药局部刺激性小,肾毒性低,溶血性低。HP-β-CD被美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于口服和注射剂的药用辅料。通过对DTX与HP-β-CD的包合制备工艺中包材与药物的摩尔比例、包合时间、包合温度的考察,并采用经方法学验证的HPLC法,对包合物增溶作用、包封率、载药量指标进行考察,结果表明DTX与HP-β-CD在25℃,摩尔比例是1：55,包合2h后,采用冷冻干燥方法制备的DTX/HP-β-CD包合物增溶效果最佳,增溶倍数达86.6,包封率达50.3%。同时通过差示扫描量热法(DSC)、X-射线衍射法(XRD)、1H-核磁共振(1H-NMR)、红外(IR)方法对包合效果进行验证,结果都显示包合物的结构与DTX显著不同,特征峰消失,DTX确已被HP-β-CD包合,而不是简单的物理混合。4.DTX磺丁基醚-β-环糊精包合物的制备研究磺丁基醚-β-环糊精(sulfobutylether-β-cyclodextrin, SBE-β-CDs)是β-CD磺化衍生物。由于磺酸基的引入,显著增加了β-CD的水溶性。由于它是离子化的环糊精衍生物,可以与离子或非离子的多种物质形成复合物。另外它的毒性较其他环糊精衍生物都低,近年来SBE-β-CD在注射剂、口服制剂、鼻腔给药、眼部给药等方面已得到比较好的应用,美国FDA批准了以其作为药物辅料的注射剂上市。通过对DTX与SBE7-β-CD的包合制备工艺条件：主客分子摩尔比例、包合时间、包合温度进行研究,同样采用HPLC法对包含物的增溶作用、包封率、载药量指标进行考察。研究结果表明DTX与SBE7-β-CD在25℃,摩尔比例是1：70,包合时间为2h,采用冷冻干燥方法制备的DTX/SBE7-β-CD效果最好。包合物的溶解度达到443.4μg/mL,是DTX的152.7倍,是DTX/HP-β-CD包合物的1.76倍；载药量达0.36%,包封率达88.7%,较DTX/HP-β-CD包封率提高38%。同样采用DSC、XRD、1H-NMR、IR方法对包合物的结构进行验证,DTX确已被SBE7-β-CD包合,而不是简单的物理混合。5.DTX抗肿瘤及诱导细胞凋亡的研究采用MTT法初步考察DTX在100-400 nmol-1浓度范围内,药物作用24h的情况下对不同肿瘤细胞系的抗肿瘤活性。结果显示：Hela细胞较ECA-109、PC-3、HepG2对DTX敏感。通过电镜观察,药物作用前后细胞的形态发生明显变化。