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背景:随着血管吻合及器官保存技术的不断进步,以及吗替麦考酚酯、他克莫司等新型免疫抑制剂的开发和应用,器官移植技术得以不断发展;其中,肾移植开展最早、发展最快、诊疗技术最成熟、目前完成病例数最多,已逐步成为终末期肾脏疾病的主要治疗手段。临床上,因肾移植医疗资源消耗大、供体稀缺、费用高,使得其疗效期望值较高。导致移植肾功能损伤甚至早期移植失败的因素较多,其中肾脏缺血再灌注损伤(ischemia/reperfusion injury,IRI)是包括感染、心脑血管事件、免疫排斥等在内的重要因素之一。齐墩果酸(oleanolic acid,OA)属于五环三萜类化合物;最近研究表明OA可参与调节细胞增殖、生长、凋亡等生物过程,对急性脏器损伤具有保护作用;推测其对肾脏IRI亦具备保护作用。深入研究IRI的分子机制以及在肾移植中的影响,积极探寻有效的药物及分子治疗靶点,减少及避免IRI导致的移植肾损伤,对于临床防治和科学理论研究都有重大意义。目的:观察缺血再灌注对肾脏功能的损伤;OA在肾缺血再灌注损伤过程中对肾脏功能丢失、氧化应激、炎症反应及细胞凋亡的影响;揭示OA减轻缺血再灌注肾损伤的药理作用及分子机制。方法:实验分为两个部分。第一部分:齐墩果酸对肾缺血再灌注损伤的保护作用1.构建肾缺血/再灌注损伤大鼠模型,在造模前采用不同浓度(12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg)的OA进行大鼠腹腔注射进行预治疗,设立对照组。2.采集大鼠静脉血液标本,采用生化法检测其肌酐、尿素氮浓度。3.收集大鼠血液及肾脏组织,采用ELISA酶联免疫法等检测人肾损伤分子1(Kim-1)、乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、INF-γ、IL-6、IL-10及髓过氧化物酶(MPO)的表达,检测细胞凋亡,观察OA对缺血再灌注肾脏功能损伤、氧化应激、炎症反应及细胞凋亡的影响。第二部分:齐墩果酸减轻肾缺血再灌注损伤的作用机制探讨1.构建肾缺血/再灌注损伤大鼠模型,在造模前采用50mg/Kg OA或50mg/kg OA+BSO(丁硫酸亚砜胺,为GSH的抑制剂)进行大鼠腹腔注射进行预治疗,设立对照组。2.采集大鼠静脉血液标本,采用生化法检测其肌酐、尿素氮浓度。3.收集大鼠血液及肾脏组织,采用ELISA酶联免疫法等检测肾脏损伤因子(KIM‐1、LDH),氧化应激标志物MDA,炎症因子IFN‐γ的表达及细胞凋亡率,观察OA减轻肾缺血再灌注损伤的保护作用及抗细胞氧化应激、炎症反应及细胞凋亡是否依赖于GSH功能维持。4.采用Trizol法提取总RNA,运用RT-q PCR技术检测模型大鼠肾脏中Nrf2和GCLc催化亚基m RNA的表达,分析OA或BSO干预对Nrf2和GCLc m RNA表达的影响。结果:第一部分:齐墩果酸对肾缺血再灌注损伤的保护作用1.采用外科血管夹闭技术阻断肾脏血液灌注成功构建了肾缺血再灌注损伤大鼠模型;在造模15天前给予大鼠进行腹腔OA或BSO注射干预,进展顺利。2.肾脏发生缺血再灌注损伤后,大鼠血肌酐/尿素氮升高,LDH、KIM-1表达增加;予以OA预治疗,大鼠血肌酐/尿素氮、LDH及KIM-1水平相对下降,并表现为OA剂量依赖。3.肾脏发生缺血再灌注损伤后,大鼠MDA表达明显增加,而SOD、CTA、GPx、GSH活性明显下降。予以OA预治疗,大鼠MDA表达明显减少,而SOD、CTA、GPx、GSH活性明显上升,这种效应并和OA浓度密切相关。4.肾脏发生缺血再灌注损伤后,大鼠IFN-γ、IL-6及MPO表达明显增加,而IL-10表达明显下降。予以OA预处理后,大鼠IFN-γ、IL-6及MPO表达明显减少,而IL-10增多。5.肾脏发生缺血再灌注损伤后,大鼠肾脏细胞凋亡增加,凋亡蛋白酶3表达明显增加。予以OA预处理后,大鼠细胞凋亡数明显减少,凋亡蛋白酶3表达降低,这种效应并表现于OA浓度依赖。第二部分:齐墩果酸减轻肾缺血再灌注损伤的作用机制探讨1.OA+BSO+I/R组大鼠BUN、Cr、KIM-1、LDH、MDA、IFN-γ的表达水平及细胞凋亡率明显高于OA+I/R组大鼠。2.I/R组大鼠Nrf2 m RNA相对表达量为0.217?0.032,明显低于对照组大鼠(为1.024?0.085)。OA+I/R组大鼠Nrf2 m RNA相对表达量明显高于I/R组大鼠;OA+I/R组大鼠Nrf2 m RNA相对表达呈OA剂量依赖趋势。3.I/R组大鼠GCLc m RNA相对表达量为0.158?0.014,明显低于对照组大鼠(为1.089?0.052);OA+I/R组大鼠GCLc m RNA相对表达量明显高于I/R组大鼠;OA+I/R组大鼠GCLc m RNA相对表达呈OA剂量依赖趋势。结论:OA预治疗可减轻缺血再灌注肾脏功能损伤、细胞氧化应激、炎症反应及细胞凋亡;OA在肾缺血再灌注损伤中的保护作用依赖于GSH综合体,Nrf2/GCLs可能是其下游信号通路。