希金斯炭疽菌(Colletotrichum higginsianum)是一种重要的植物病原真菌,可为害多种十字花科植物,比如萝卜属(Raphanus)和芸薹属(Brassica)中的多种蔬菜作物,引起严重的炭疽病。华南地区高温高湿的气候条件非常有利于十字花科蔬菜如菜心炭疽病的发生,病害严重时产量损失可达30%~40%。迄今为止,从细胞水平和分子水平上研究希金斯炭疽菌致病机理的报道甚少。本研究通过对希金斯炭疽菌候选效应分子的预测、筛选和功能分析,旨在更好地了解效应分子在该病菌致病过程中的作用,为病原菌与寄主植物互作分子机制的研究提供重要依据。现将研究结果报道如下。根据最近公布的希金斯炭疽菌全基因组序列,利用生物信息学技术对其候选效应分子进行了预测。通过SignalP、TMHMM、Protcomp、big-PI Predictor和TargetP等生物信息学软件和数据库预测获得候选的希金斯炭疽菌外泌蛋白,然后根据蛋白中半胱氨酸的含量和序列大小进行进一步的筛选,最后通过非冗余蛋白质数据库和blastp服务器作进一步分析,筛选获得无同源性或同源性较低的蛋白序列,从而得到135个希金斯炭疽菌候选效应分子。以135个候选效应分子的序列作为模板,设计了特异性引物,通过希金斯炭疽菌不同生长阶段的cDNA对效应分子基因进行PCR克隆,构建植物高效表达载体及烟草注射瞬时表达,成功筛选获得了12个能诱导烟草细胞坏死的效应分子。但在效应分子与INF1共注射的实验中,所有效应分子都不能抑制烟草坏死,因此未获得抑制寄主细胞免疫反应的效应分子。在12个效应分子中,皆为假定蛋白,只有1个具有功能域,其他都是功能未知蛋白。最后通过Western Blot技术验证了12个效应分子皆能够在烟草叶片细胞中成功表达。以上结果表明,通过农杆菌介导的烟草叶片注射瞬时表达的方法进行功能性效应分子的筛选是可行的。最后,选取诱导烟草坏死程度最大的效应分子ChEP011为研究对象,进一步研究其功能。首先通过生物信息学技术分析ChEP011的基因序列、信号肽序列、翻译蛋白的理化性质和功能;接着,预测ChEP011的信号肽,分析信号肽的位置与长度,构建载体,以明确信号肽的作用。结果表明,去掉信号肽后的ChEP011效应分子不能诱导叶片发生变薄或坏死现象,即信号肽影响效应分子对寄主的坏死作用。同时,通过构建荧光载体研究信号肽对效应分子对其亚细胞定位的影响。结果表明,在病原菌与寄主互作过程中ChEP011被分泌在寄主的细胞膜上。综上所述,ChEP011的信号肽序列对其功能起着重要作用。