蛛网膜下腔出血大鼠血浆细胞外囊泡中miRNA的初步研究

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目的:蛛网膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage,SAH)后脑血管痉挛(Cerebral vasospasm,CVS)是蛛网膜下腔出血后的严重并发症。CVS的病死率为12%-18%,严重威胁患者生命安全。细胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)包括外泌体、核外颗粒体和凋亡小泡,在异常和正常生理条件下被释放。了解血浆来源的EVs中microRNA(miRNA)的表达将对SAH后CVS的认识有重要意义。方法:体重250-300g的SD大鼠分为sham组和SAH组,SAH采用颈内动脉穿刺法建立。分别提取两组大鼠基底动脉行HE染色检测,收集4只SAH组SD大鼠和4只sham组SD大鼠的血浆标本,采用试剂盒法提取EVs。透射电镜观察EVs形态;粒径分析检测EVs大小分布范围;WB检测EVs表面标记CD9、CD63、Tsg101、Alix和Calnexin的表达情况。分别抽提SAH大鼠血浆和sham组大鼠血浆EVs中的总RNA,运用新一代测序技术结合生物信息学分析获得两组实验组的miRNA差异表达谱;使用RT-PCR对EVs的初筛差异miRNA中随机选择5个miRNA进行验证;对差异miRNA进行GO注释、信号通路分析,揭示其作用于CVS的可能机制。结果:1.通过颈内动脉穿刺法能够构建SAH模型,大体标本可见大量的血凝块聚集在willis环、小脑延髓池、脑干腹侧。HE染色可见SAH组大鼠基底动脉管径较sham组狭窄并增厚。2.透射电镜和粒径分析表明,SAH组和sham组大鼠血浆分离出中的EVs呈椭圆形或碗形,粒径范围在75 nm~200 nm之间,两组大鼠血浆EVs中均可检测到CD9、CD63、Tsg101和Alix的表达,但检测不到Calnexin的表达。3.miRNA差异表达谱获得:从SAH组和sham组大鼠共获得了142个差异miRNA表达,包括73个表达上调和69个表达下调。4.实时荧光定量PCR对差异表达谱的验证结果:随机选取的差异miRNA(rno-miR-185-5p,rno-miR-103-3p,rno-miR-15b-3p,rno-miR-93-5p和rno-miR-98-5p)的上调趋势与测序结果一致。结论:筛选出的5个miRNA(rno-miR-185-5p,rno-miR-103-3p,rno-miR-15b-3p,rno-miR-93-5p和rno-miR-98-5p)在SAH组和sham组的样本中的表达有较为显著的差异。通过验证实验证实这些差异性的表达是可信的,并且进一步预测了他们的靶基因可能参与的信号通路。这些发现有助于开发SAH后CVS潜在的预防、诊断和治疗靶点。
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