研究背景及研究目的唇腭裂是口腔颌面部最常见的先天性发育缺陷,从遗传学角度可以将其分为：非综合征性唇裂伴或不伴腭裂[non-syndromic cleft lip with or without cleft palate (NSCL/P)]、非综合征性单纯腭裂[non-syndromic cleft palate only (NSCPO)]、综合征性唇裂伴或不伴腭裂[syndromic cleft lip with or without cleft palate (CL/P)]以及综合征性单纯腭裂[syndromic cleft palate only (CPO)]。其中,非综合征性唇裂伴或不伴腭裂(NSCL/P)和非综合征性单纯腭裂(NSCPO)是一类不伴发其他系统或器官畸形的疾病,是不在综合征之内的单纯唇裂、唇裂合并腭裂、或单纯腭裂的总称,此类唇腭裂是由复杂的遗传因素和环境因素共同作用而导致的多基因、多因素遗传性疾病。腭部发育包括腭突(腭板)的垂直向生长、抬起、水平向生长、接触和融合等一系列过程。腭部的正常发育需要机体对腭部上皮细胞和间充质细胞所涉及的关键生理过程,诸如细胞生长、细胞增殖、程序性细胞死亡、上皮-间质转化[epithelial-mesenchymal transition (EMT)]、细胞迁移和信号传导等进行精准的调控。在机体调控腭部发育的诸多环节中,任何一个环节出现问题或调控偏差,都将有可能导致腭裂的发生。已有充分证据表明,在腭部发育过程中,腭板间充质细胞成分和上皮细胞成分参与的多项生物活动均与转化生长因子(transforming growth factor,TGF)β家族有着重要的联系。目前对哺乳动物的相关研究发现,TGFβ家族至少包括四个亚型(TGFβ1, 2,3和TGFβ1β2).而前三者均在小鼠腭部发育的早期即有所表达：胚胎第11.0-11.5天,腭突自上颌突长出并垂直向下生长,此时在两腭突的上皮细胞中可检测到TGFβ3的表达；胚胎第12.0-12.5天,两腭突继续呈垂直向生长,其上皮和间充质细胞中均可检测至TGFβ1和TGFβ2的表达；胚胎第13.0-13.5天,腭突(腭板)抬起至呈水平方向,腭板上皮细胞中可检测至TGFβ3的高表达及TGFβ1的表达,间充质细胞中则呈现TGFβ1的少量散在表达和TGFβ2的强而广泛的表达；胚胎第14.0-14.5天,在经历水平向生长后,两腭突(腭板)即将相互接触,TGFβ1,2和3在腭突中均有所表达；胚胎第15.0-15.5天,两腭突(腭板)互相接触并开始融合(该过程可能涉及上皮-间充质转化及细胞凋亡等机制),TGFβ1 3表达量明显降低,而TGFβ2在腭中缝两侧的间充质组织中则有较强的表达;胚胎第16.0-16.5天,腭突在中线处融合,TGFβ1的表达仅局限于腭突和鼻中隔的骨化区,TGFβ2在腭部中线附近的间充质中散在表达,而TGFβ3主要在间充质细胞中表达。以上证据充分表明TGFβ家族可能在腭部发育过程中发挥着重要的调节作用。TGFβ基因敲除小鼠模型的表现型亦提示TGFβ在腭部发育过程中的关键作用。TGFβ1和TGFβ2基因敲除小鼠在出生之前即死亡,因此不能用作腭部发育的研究模型；而TGFβ3基因敲除小鼠出生时总是表现出非综合征性单纯腭裂,并于出生后24小时内死亡,是研究腭部发育的较为理想的动物模型之一。动物实验中,外源性给予胎鼠TGFβ3可以纠正TGFβ3基因敲除小鼠的唇腭裂缺陷,进一步提示TGFβ可能参与腭部发育过程的调控。在腭裂研究的各种动物模型中,两腭板正常抬起后因无法接触融合而引发的腭裂是最常见的一种类型。在口腔各部位的上皮细胞中,周皮细胞作为一层保护性细胞,在发育早期可有效防止邻近的组织在未成熟阶段发生错误性的粘附和融合,进而避免一系列的发育畸形,腭部上皮细胞亦是如此。在腭部发育过程中,腭板表面被覆单层立方状的基底细胞样上皮细胞,其逐步层化而形成位于表层的扁平状上皮细胞,即为腭周皮细胞,腭周皮细胞在腭部发育早期可防止腭板过早的与邻近组织发生融合。然而在腭部发育的后期,当左、右两腭板抬起、经历水平向生长,并于中线处相互接触时,腭周皮细胞的适时脱落,则成为两腭板互相粘附并形成腭中缝上皮带的必要条件之一。反言之,腭周皮细胞继续存留将可能导致腭裂的发生。然而基底层腭板上皮细胞如何保持单层立方状细胞结构,以及其层化形成腭周皮细胞的机制尚不清楚,腭部发育后期腭周皮细胞脱落的具体调节机制也尚待研究。TGFβ3在腭板融合及腭周皮细胞脱落的过程中发挥着重要的调节作用。尽管TGF β 3在腭中线上皮细胞(Medial edge epithelia, MEE)中的表达规律与腭周皮细胞形成和脱落的规律在时间上呈现出一定的相关性,但其在腭中线上皮细胞的分化和腭周皮细胞脱落中的具体作用机制尚未得到系统的研究。目前已有研究表明,借助于干扰素调节因子6 (Interferon Regulatory Factor 6, IRF6)的调节,△Np63可有效促进上皮细胞的分化及周皮细胞的活化。有趣的是,ΔNp63、TGFβ3和IRF6三种基因敲除小鼠模型中,新生小鼠均伴有腭裂,且皆因其双侧腭板未能融合所致(三型基因敲除小鼠腭裂形成的具体原因各不相同),进一步表明这些基因在调节腭部上皮细胞分化的过程中可能发挥着重要的作用。尽管上述三种基因敲除小鼠的腭裂表现及其发病机制均已有相应的文献支持,但迄今为止,有关三者在腭部发育过程中的协同作用机制尚未见文献报道。在此,我们假设TGFβ3通过调节IRF6和△Np63的表达水平而影响腭周皮细胞的形成和脱落,从而参与腭部发育过程的调控。实验中分别对TGF β 3基因敲除型、△Np63基因敲除型和野生型(wild-type,WT)小鼠胚胎(胎鼠)的头颅冠状切片及由野生型小鼠取材并行原代培养得到的MEE细胞,进行了生化分析、基因活性分析和蛋白表达分析等相关的研究,以验证该假设成立与否,进而揭示TGFβ3、IRF6和△Np63在腭部发育过程中调控腭周皮细胞形成和脱落的具体作用机制。研究方法1.对胚胎第14.5天[dpc (days post coitum)]的TGFβ3基因敲除型,△Np63基因敲除型及野生型小鼠头颅冠状石蜡切片进行H&E染色,以从形态学分析此时期各型胎鼠的腭板结构及细胞组成。2.应用扫描电子显微镜(SEM)对胚胎第14.25天的TGFβ3基因敲除型及野生型胎鼠腭板表面进行扫描,以从微观上观察腭板表面上皮细胞的形态和结构特点。3.应用原子力显微镜(AFM)结合针尖增强拉曼(TERS)光谱术,对胚胎第14.25天的TGFβ3基因敲除型及野生型胎鼠腭板表面进行扫描,以纳米级分辨率获得腭板表面形貌结构信息及表面粗糙度信息。4.对腭部发育不同时期的TGFβ3基因敲除型,△Np63基因敲除型及野生型小鼠头颅冠状石蜡切片进行免疫组织化学染色和免疫荧光双重染色,以从蛋白水平确定腭部发育过程中,腭板间充质细胞和上皮细胞中相关蛋白的表达情况。5.采用原代培养的野生型小鼠腭中线上皮细胞(MEE),研究TGFβ基因对△Np63和IRF6表达的调节作用。用不同剂量(0.5,1.0,3.0,5.0和10. Ong/ml)的外源性重组人类TGFβ3 (rTGFβ3)处理腭中线上皮细胞,并于不同时间点(12小时,24小时,36小时和48小时)分别提取蛋白质和mRNA,并分别采用Western Blot技术检测△Np63和IRF6蛋白的表达变化,采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测△Np63和IRF6 mRNA的水平变化。6.以pGL3作为载体,构建小鼠重组△Np63萤光素酶报告基因质粒,用该质粒转染MEE细胞后,采用外源性重组人类TGFβ3(rTGFβ3)处理细胞,通过重组质粒萤光素酶活性分析,检测△Np63启动子活性。结果1.小鼠头颅冠状石蜡切片的H&E染色,扫描电子显微镜(SEM)分析及原子力显微镜(AFM)分析结果,均显示腭板抬起至水平向以后,随着腭板的生长,至二者相互接触前,野生型(WT)胎鼠腭板表面的腭周皮细胞逐渐发生皱缩、突起、变圆等改变,直至后期自腭板表面脱落,因此其腭板表面较粗糙,且两腭板接触后形成腭中缝上皮带；而TGFβ3基因敲除(-/-)型胎鼠的腭周皮细胞始终存留于腭板表面,腭板表面光滑,表层细胞健康,且在两腭板接触后,接触区的双层腭板上皮细胞之间尚嵌有一层扁平状的腭周皮细胞,因此两腭板接触不紧密。2.小鼠头颅冠状石蜡切片的免疫组化染色及免疫荧光染色结果显示：a.腭部发育后期,野生型胎鼠腭板上皮细胞表面尚有一层不连续的扁平状细胞,且有凋亡小体检出；而TGFβ3基因敲除型胎鼠腭板表面的扁平状细胞排列紧密,且无细胞凋亡状况。b.腭部发育过程中,腭板最表层的单层扁平状细胞确为腭周皮细胞,因其表达腭周皮细胞特异性标记蛋白。c.在两腭板水平生长至即将接触之前,野生型胎鼠腭板接触融合区的腭板上皮细胞核内△Np63的表达明显降低,而TGFβ3基因敲除型胎鼠的腭中线上皮细胞内△Np63呈现持续的高表达,提示腭板发育后期TGFβ3可能通过下调△Np63的表达水平,从而促进腭周皮细胞脱落。d.腭部发育早期,△Np63基因敲除型胎鼠的腭板表面腭周皮细胞缺如,但是在腭板抬起至水平向以后,腭板的鼻腔侧迅速与鼻中隔区域发生融合；而腭板的口腔侧上皮出现少量腭周皮细胞。e.IRF6在腭板内的分布与表达情况,均不受TGFβ3或者△Np63基因敲除与否的影响。3. Western Blot及实时定量PCR检测结果显示,采用外源性TGFβ3对原代培养的MEE细胞进行处理,可明显降低△Np63的表达水平,但IRF6的表达未受影响。4.萤光素酶活性分析结果显示,TGFβ3处理被转染的MEE细胞,可明显降低△Np63的启动子活性。结论1.两腭板水平生长至互相接触前,WT胎鼠腭板表面的腭周皮细胞脱落,两腭板互相融合,形成完整的腭部结构；而TGFβ3 KO胎鼠的腭周皮细胞仍然存留,阻碍了腭板的融合,引发腭裂；2. TGFβ3 KO胎鼠的腭周皮细胞之所以存留,与IRF6和△Np63的持续高表达有关；腭周皮细胞的凋亡和脱落依赖于TGFβ3对△Np63的功能性抑制作用,与IRF6的表达无关；3.ΔNp63 KO胎鼠发生腭裂与TGFβ3 KO胎鼠源于完全不同的机制,前者是由于腭板抬起后与鼻中隔结构发生过早的融合,阻碍了腭板的水平生长和接触而引起腭裂；4.腭部发育过程中,TGFβ3对△Np63发挥重要的调节作用：腭部发育初期,IRF6的转录激活(可能由Wnt/TGFβ1/Ephrin/Notch/Jag2等介导)可有效上调△Np63的表达,进而促进腭周皮细胞的形成及维持；而腭部发育后期,TGFβ3大量表达,抑制△Np63的表达,导致腭周皮细胞脱落,以利于后期腭板接触后发生融合。