论文部分内容阅读
中风是导致人类死亡的三大疾病之一，是因病致残的首要原因，也是世界范围内一个主要的公共健康负担。对中风病理生理和防治药物的长期研究表明，这类危险因素众多、病理生理变化繁复的复杂性疾病，单纯针对某一个单一的分子靶点，甚或某一单一类型的细胞，都难以收到良好的治疗效果(如神经保护剂的研发现状)。故而近年来提出了联合治疗和鸡尾酒疗法的设想，并已有部分方案进入临床。中国传统医学一贯主张和强调综合调理，强调调动人体自身的代偿与防卫体系来抵御各种致病因素的不良影响。活血化瘀药消栓通络方以血管和经络为起点而通达全身，调动躯体网络的多种细胞与分子成分，促进脑血管病变后的结构和功能重塑，从而发挥其防治脑血管疾病的效应。然而我们对其作用的物质基础和作用机理等尚缺乏较为系统深入的了解。本研究结合多年来中药现代研究经验和中医药的系统整体观念，在实验室前期研究的基础上，探讨了消栓通络方有效成分组对缺血性脑血管疾病的防治效应与作用机理。
⑴消栓通络方有效成分组的筛选与确定。根据脑缺血损伤的病理生理基础，选用内皮细胞低氧损伤模型、血管环舒张实验、神经细胞低氧损伤模型、脑线粒体脂质过氧化模型以及DPPH氧自由基清除模型，对多种萃取方法以及大孔树脂方法从消栓通络方中制备的16个组分进行了两轮筛选。在前期138个连续组分筛选的基础上，结合上述各模型筛选和各组分成分分析结果，以及规模生产的需要，确定了消栓通络方的有效成分组及制备工艺。
⑵消栓通络方有效成分组对缺血性脑血管疾病的防治效应。①消栓通络方有效成分组对右旋糖酐所致血瘀和脑微循环障碍的影响。小鼠经尾静脉注射右旋糖酐和伊文思兰后出现明显的血瘀征象，同时有微循环障碍，脑血流量下降31.6±10.8％，而预先灌胃给予消栓通络方有效成分组可以缓解血瘀征象，改善脑部微循环障碍。②消栓通络方有效成分组对大鼠急性脑缺血损伤的保护作用。大鼠大脑中动脉栓塞24小时后，动物出现明显的神经行为功能障碍，大脑中动脉供血区域出现较大范围的梗死(28.8±3.5％)。消栓通络方有效成分组(XECG)能缩小脑梗死范围，改善神经行为障碍。实验发现，XECG能抑制缺血后异常激活的iNOS，降低脑内异常升高的NO水平。同时缺血后脑内白细胞浸润增加，MPO活性升高，而XECG能有效抑制MPO活性的异常升高。实验还发现，XECG能抑制缺血后脑内促凋亡蛋白Bax的过度表达，有助于Bcl—2家族平衡的回复。上述结果提示XECG可能通过抑制iNOS的过度激活和缺血后炎症反应，抑制缺血后组织细胞凋亡等多种途径改善脑缺血损伤。③消栓通络方有效成分组对大鼠慢性脑缺血损伤的保护作用。大鼠双侧颈总动脉结扎致长期慢性缺血后，脑内，尤其是海马区神经元损伤与脱失明显，同时可见脑内星形胶质细胞增生，小胶质细胞活化，并有白质疏松和脱髓鞘现象。KB染色发现纤维排列紊乱并有空泡形成，部分甚至可见有髓鞘神经纤维消失。Morris水迷宫检测发现，XECG能改善慢性脑缺血所致的大鼠学习记忆能力缺陷。同时，组织病理学检查和免疫组化结果显示，XECG可改善缺血所致的海马区神经元损伤与脱失，改善脑白质疏松。④消栓通络方有效成分组对缺血后脑血管反应性的影响。已有的基础与临床研究表明脑缺血后血管反应性降低，而且血管反应性的高低也和中风患者的临床预后有关。通过对大鼠脑缺血后胸主动脉的收缩反应以及乙酰唑胺负荷实验中脑血流量变化的检测结果发现，双侧颈总动脉结扎后大鼠血管反应性明显降低，而XECG则能明显改善缺血后的脑血管反应性，注射乙酰唑胺后脑血流量的增加由模型对照组的2.1±1.8％上升至高剂量组的21.4±8.4％。脑血管灌注造影结果显示，XECG给药组大脑后动脉等较对照组有所增粗，侧枝循环改善。
⑶消栓通络方有效成分组防治脑缺血损伤的作用机制研究。①XECG对脑缺血后血管新生的影响。脑缺血后血管新生在组织修复与功能重建中起重要作用，与中风患者的生存期呈正相关。本部分实验采用Ki67和vWf免疫组化标记检测缺血后血管管径、密度以及内皮细胞增殖情况。结果显示，XECG给药组脑内毛细血管密度增加，管径有所增大，内皮细胞增殖明显。提示XECG能促进缺血后血管生成。这也可能是其改善缺血后脑血流与血管反应性的基础之一。②XECG对缺血后脑内生化与分子环境的影响。中药复方不仅通过直接影响相关的分子靶标而发挥作用，更在于改善机体内环境，充分调动机体各种内源性的力量而发挥其防病治病效应。脑缺血后的血管新生与神经再生等重塑过程也依赖于全身和局部分子及细胞环境的改善。通过对缺血后血液粘度、脑内NO含量、iNOS活性的测定，以及VEGF、BDNF、APJ、Tie—2和Flk的检测，发现XECG能降低血液粘度，改善血液流动环境。而且能降低脑内异常激活的iNOS活性和NO的异常升高，同时能促进VEGF等促血管生成因子的表达，从而为缺血后的血管生成和功能重建提供了有益的机体环境。③XECG及消栓通络方中部分化合物对内皮细胞低氧损伤的作用与机制研究。氯化钴能有效模拟低氧所诱导的多种分子事件，本部分实验采用氯化钴诱导EA．hy926内皮细胞低氧损伤模型，探讨XECG内主要组分和化合物对内皮细胞低氧损伤的保护作用及机理。实验结果表明，XECG内多种组分对内皮细胞低氧损伤有不同程度的保护作用，其中金丝桃苷、黄芪甲苷、斛皮素、三七皂苷尤为明显。通过对其机理进一步研究发现，它们能抑制细胞内活性氧的异常生成，抑制Bax和caspase—3的异常表达与激活，从而抑制CoCl2所诱导的内皮细胞损伤。