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淫羊藿（Epimedium davidii Franch）为我国传统的补益中草药,具有“益精气,坚筋骨,补腰膝,强心力”之功效。随着近年来对其药理学功能研究的日益深入,人们发现淫羊藿苷（Icariin,ICA）为淫羊藿的主要药理有效成分。诸多临床和实验药理研究表明,ICA具有抗病毒、抗氧化、免疫增强等效果。然而,由于黄酮类成分水溶性较差,在实际临床应用时经常会造成一定的不便。为了提高ICA的生物利用率,更好地发挥其抗病毒效果,便于在临床推广应用,通过混合磷酸盐法成功的对ICA进行了磷酸化修饰,得到磷酸化淫羊藿苷（phosphated Icariin,pICA）。在本项目组前期的试验中,我们发现感染1型鸭肝炎病毒（Duck hepatitis A virus,DHAV-1）可以导致雏鸭发生严重的肝损伤,且这种肝损伤与其体内严重的氧化应激存在显著的相关性,这说明DHAV-1感染雏鸭引起的炎症损伤与氧化应激损伤有着密切联系,当引入ICA与pICA治疗之后,雏鸭体内炎症因子水平显著下降、抗氧化酶活性明显提升,最终存活率得到显著提升,表现出良好的治疗效果,这种疗效可能与ICA与pICA的抗炎症作用及抗氧化应激作用有关。但上述研究仅局限于整体动物水平,其中的分子机制仍不清楚。因此,为了更深入的探究ICA与pICA的抗DHAV-1机理,验证之前在体内试验中的猜测,本文在体外鸭胚肝细胞（Duck embryonic hepatocytes,DEHs）上研究了 ICA与pICA对DHAV-1引起的炎症反应、氧化应激、线粒体损伤、细胞凋亡及细胞增殖的影响。本试验分为以下六个部分:试验Ⅰ ICA与pICA缓解DHAV-1诱导DEHs炎症反应作用的研究本试验旨在研究DHAV-1诱导DEHs产生炎症反应的机制及ICA和pICA的缓解作用。首先采用ELISA和q-PCR检测了感染DHAV-1及加入ICA和pICA处理后DEHs的炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α含量及其基因mRNA表达水平,之后用q-PCR和WB法检测了受炎症反应影响的NF-κB途径中的关键调控节点如TLR家族关键因子（TLR 2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、Myd88）的基因 mRNA 表达水平及对 TLR2、TLR 4、Myd88及NF-κB p65蛋白表达水平的影响。结果显示感染DHAV-1后DEHs分泌的IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α含量显著升高,相关基因mRNA表达结果亦证实了这一现象,同时 TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR7、Myd88 基因 mRNA 表达及 TLR 2、TLR4、Myd88蛋白表达亦显著增强,促进了 NF-κBp65蛋白磷酸化。而加入ICA和pICA后则显著降低了炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α含量及基因mRNA表达,降低了 TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR 7、Myd88 基因 mRNA 表达及 TLR 2、TLR 4、Myd88蛋白表达同时抑制了 NF-κB p65蛋白磷酸化。说明DHAV-1可以通过TLR从Myd88依赖型和非Myd88依赖型两种途径激活NF-κB通路,最终引起细胞的炎症反应。ICA与pICA则可以降低上述指标,通过降低机体炎症程度来起到治疗作用。同时相比较于ICA,pICA更能缓解炎症反应。试验Ⅱ ICA与pICA缓解DHAV-1诱导DEHs氧化应激作用的研究本试验旨在研究ICA与pICA对DHAV-1诱导DEHs发生氧化应激的缓解效果。首先通过ELISA检测了感染DHAV-1及加入ICA和pICA处理后DEHs的氧化应激相关指标SOD、MDA、CAT、GSH和GSH-Px,之后通过加入H2O2这一促氧化剂（分为先加入DHAV-1后加入H2O2和先加入H2O2后加入DHAV-1两种方式）来反向干预验证ICA与pICA的抗氧化作用,最后用Reed-Muench法检测了 H2O2干预前和干预后,ICA与pICA对病毒本身毒力有无影响。试验结果显示,DHAV-1处理后DEHs的MDA含量显著上升而SOD、CAT、GSH、GSH-Px活性显著下降,ICA与pICA则可以降低DEHs的MDA含量,增加SOD、CAT、GSH、GSH-Px活性。在两种不同顺序干预方式中,加入H2O2后的干预实验组抗病毒效果均低于未加入H2O2干预的对照组,同时干预前后,ICA与pICA组病毒TCID50均小于VC组,而H2O2干预后的各组TCID50又一一大于干预前各组TCID50。本章试验说明ICA与pICA在体外可以通过降低MDA含量、提高相关抗氧化酶活性来起到抗氧化作用,而H2O2的干预试验反向证明了在体外ICA与pICA的抗氧化作用对于抗DHAV-1来说是必需的,此外,相比于ICA,pICA更能显著提高SOD与GSH-Px等抗氧化酶的酶活性。试验Ⅲ ICA与pICA对DHAV-1诱导的DEHs氧化应激的调控机制本试验旨在研究ICA与pICA缓解DHAV-1在体外造成DEHs氧化应激的具体调控机制。首先用WB法检测了感染DHAV-1及加入ICA和pICA处理后DEHs的SOD和GSH-Px的蛋白表达,之后用q-PCR法检测了抗氧化应激相关因子Nrf2、NQO1、HO-1、GST、GCLC和GCLM基因mRNA表达,最后用WB法检测了 MAPKs信号通路相关ERK1/2、JNK、p38蛋白表达。试验结果显示,pICA的SOD与GSH-Px蛋白丰度显著高于 ICA,而感染 DHAV-1 的 DEHs 中 Nrf2、NQO1、HO-1、GST、GCLC 和GCLM基因mRNA表达均显著降低,而加入ICA与pICA后Nrf2、NQO1、HO-1、GST、GCLC和GCLM基因mRNA表达均有一定回升,其中pICA组GST和GCLC基因mRNA表达显著高于ICA组而ICA组GCLM基因mRNA表达显著高于pICA组。MAPKs信号通路相关蛋白结果显示感染DHAV-1后DEHs中ERK1/2、JNK、p38蛋白磷酸化显著升高而ICA和pICA可以显著降低ERK1/2、JNK、p38蛋白磷酸化,同时pICA组还显著低于ICA组。本章试验说明DHAV-1可以显著降低Nrf2基因mRNA表达从而抑制下游NQO1、GST、HO-1、GCLC及GCLM基因mRNA表达,造成严重的氧化应激损伤,而ICA与pICA则可以通过提高上游Nrf2基因mRNA表达从而提高下游NQO1、GST、HO-1、GCLC及GCLM基因mRNA表达来起到抗氧化作用。DHAV-1还可以促进MAPKs信号通路中ERK1/2、JNK和p38的蛋白磷酸化而pICA比ICA可以更显著的抑制ERK1/2、JNK和p38的蛋白磷酸化,这说明ICA与pICA不仅可以通过提高机体抗氧化活性来抵御病毒,也有可能通过影响MAPKs介导的其他途径如炎症、细胞凋亡、细胞增殖等来起到抗病毒作用,而pICA的抗氧化性更优于ICA。试验Ⅳ ICA与pICA缓解DHAV-1诱导的DEHs线粒体损伤的作用研究本试验旨在研究DHAV-1造成DEHs线粒体损伤的机制及ICA和pICA的缓解作用。首先通过流式细胞仪检测了感染DHAV-1及加入ICA和pICA处理后DEHs的线粒体膜电势、线粒体内ROS水平及Ca2+浓度,之后检测了 COX和SDH的酶活,最后通过化学发光检测仪检测了 ATP的含量。试验结果显示DHAV-1可以显著降低线粒体膜电势,升高线粒体内ROS水平和Ca2+浓度,同时抑制COX和SDH的酶活,导致ATP含量显著下降。而加入ICA与pICA作用后,可以维持线粒体膜电势稳定,降低线粒体内ROS水平,降低Ca2+浓度,同时提高COX和SDH的酶活,维持ATP的稳定生成。这说明DHAV-1可以通过氧化应激来破坏线粒体膜通透性来改变线粒体结构,抑制线粒体呼吸链酶活性,从而降低ATP生成来起到致病作用,而ICA和pICA可以通过维持线粒体氧化呼吸链和三羧酸循环等内部功能的稳定来抵御DHAV-1对线粒体的损伤。此外,pICA对线粒体功能的保护性更优于ICA。试验Ⅴ ICA与pICA缓解DHAV-1诱导DEHs细胞凋亡作用的研究本试验旨在研究DHAV-1诱导DEHs细胞凋亡的机制及ICA和pICA的缓解作用。首先通过流式细胞仪观察感染DHAV-1及加入ICA和pICA处理后DEHs的细胞凋亡情况,之后通过q-PCR法比较了 DHAV-1、ICA和pICA对相关凋亡因子如Caspase家族（Caspase 3、Caspase 8、Caspase9）和 Bcl-2 家族（Bcl-2、Bax）基因 mRNA 表达的影响,最后通过WB法比较了 DHAV-1、ICA和pICA对Caspase 3、Caspase 8蛋白表达的影响。试验结果显示感染DHAV-1后DEHs的细胞凋亡率显著升高,同时Bcl-2基因mRNA表达显著下降,Bax、Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9的基因mRNA表达显著上升,Caspase3、Caspase 8蛋白表达显著上升。加入ICA与pICA后,DEHs的细胞凋亡率显著下降,Bcl-2 基因 mRNA 表达显著上升,Bax、Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9的基因mRNA表达显著下降,Caspase 3、Caspase 8蛋白表达显著下降。这说明DHAV-1可以通过上调Bax基因mRNA表达和下调Bcl-2基因mRNA表达,最终上调凋亡启动因子Caspase 8、Caspase 9和凋亡执行因子Caspase 3来促进DEHs细胞凋亡。而ICA与pICA可以通过升高Bcl-2/Bax比值来抑制线粒体孔道生成、抑制下游凋亡相关因子Caspase8、Caspase9和Caspase3来起到抑制细胞凋亡的治疗效果。此外,相比较于ICA,pICA能更好得抑制DHAV-1诱导的细胞凋亡。试验VIICA与pICA缓解DHAV-1抑制DEHs细胞增殖作用的研究本试验旨在研究DHAV-1抑制DEHs细胞增殖的机制及ICA和pICA的缓解作用。首先通过流式细胞仪观察感染DHAV-1及加入ICA和pICA处理后DEHs的细胞周期情况,之后通过q-PCR法和WB法比较了 DHAV-1、ICA和pICA对相关增殖因子CCND1和PCNA的基因mRNA表达及PCNA的蛋白表达的影响,最后通过WB法观察了对细胞增殖相关通路关键蛋白AKT和CREB的影响。试验结果显示显示感染DHAV-1后DEHs的细胞周期G0/G1期显著升高而S+G2/M期显著下降,CCND1基因mRNA和PCNA基因mRNA表达及蛋白表达显著下降,AKT及CREB蛋白磷酸化被抑制,而加入ICA和pICA后则可以降低G0/G1期比率升高S+G2/M期比率,提高CCND1和PCNA的基因mRNA表达及PCNA蛋白表达,提高AKT及CREB的蛋白磷酸化。这说明DHAV-1可以通过抑制AKT磷酸化从而抑制下游CREB蛋白磷酸化,进而影响CCND1和PCNA的表达,从而降低S+G2/M期细胞比率,使细胞周期的G1/G0期陷入阻滞并最终抑制细胞增殖。而ICA与pICA则可以通过激活AKT及使CREB磷酸化,提高CCND1和PCNA的表达,使DNA可以正常合成,从而加强细胞增殖。此外,相比于ICA,pICA能更好的拮抗DHAV-1对AKT蛋白磷酸化的抑制。最后通过Spearman相关性分析得出炎症损伤、氧化应激损伤、线粒体损伤、细胞凋亡及细胞增殖间存在强相关性,说明DHAV-1诱导的肝细胞损伤确实与这些途径有着密切联系。