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目的:构建、表达人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)重组蛋白,标记后尝试用于HIV-1新发感染捕获酶联免疫试验,初步建立结合BED试验和亲和力试验优点的HIV-1新发感染检测新方法。方法:(1)取170份HIV-1抗体阳性血浆样品,使用BED HIV-1捕获酶联免疫试验(BED HIV-1 Capture Enzyme Immunoassay,BED CEIA,简称 BED 试验)试剂盒检测,挑选标化吸光度(ODn)值有代表性的样品,组建新发感染检测试剂评价血清盘。(2)参照限制性抗原亲和力酶联免疫试验(Limiting antigen avidity enzyme immunoassay,LAg-Avidity EIA,简称亲和力试验)所用抗原rIDR-M的核心结构,设计、合成1种HIV-1重组蛋白(编号为HIV-Ag-R03)的核酸序列,将它与pET30a-Trx载体骨架连接、构建重组质粒。将重组质粒转化BL21(DE3)细胞,经异丙基硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-Thiogalactoside,IPTG)诱导表达蛋白质。重组蛋白经复性、纯化后,包被酶联板,检测48份血浆样品(其中HIV-1抗体阳性、HIV阴性各24份),以分析重组蛋白的抗原性。(3)用辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)标记HIV-Ag-R03后,取代BED试验试剂盒中的BED肽及后续组分,检测18份HIV-1阳性样品,将其结果与BED试验结果比较,探讨新模式的可行性。(4)初步建立新型捕获酶联免疫试验(简称新型CEIA试验),使用新发感染检测试剂评价血清盘进行初步评价,分别比较新型CEIA试验检测结果与BED试验、亲和力试验检测结果的相关性。结果:(1)结合样品来源和BED试验ODn值的代表性,组建了一套包含81份样品的HIV-1新发感染检测试剂评价血清盘(编号为BEDn81)。(2)构建了HIV-Ag-R03的重组质粒,核酸序列确认无误。获得了包涵体表达的蛋白质,经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium Dodecyl Sulfate-polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)分析大小与预测值一致。使用包被HIV-Ag-R03的间接酶联免疫试验检测48份血浆样品,结果HIV-1抗体阳性样品的吸光度(OD)值(0.794±0.193)显著高于HIV阴性样品的OD值(0.117±0.073),差异有统计学意义(P<0.01),说明HIV-Ag-R03具有良好的抗原性。(3)用HIV-Ag-R03-HRP取代BED试验试剂盒中的BED肽及后续组分,调试HIV-Ag-R03-HRP的最佳稀释度为1:2500,18份HIV-1阳性样品的检测ODn值2.401(1.341～4.160)与BED试验的ODn 值 0.884(0.369～1.942)相关性强(r=0.939,P<0.01),说明新模式可行。(4)用羊抗人IgG(1:500稀释)包被酶联板,使用自制HIV-Ag-R03-HRP并调试其他成分,初步建立了 1种新型CEIA试验。对血清盘BEDn81的检测结果显示,新型CEIA试验检测的 ODn 值 2.913(1.761～4.297)与 BED 试验的 ODn 值 1.114(0.557～1.675)相关性强(r=0.869,P<0.01),与亲和力试验的ODn值2.493(1.609～3.716)相关性强(r=0.810,P<0.01);新型CEIA试验检测ODn值大于BED试验和亲和力试验的ODn值,提示它对新近感染和长期感染样品的区分能力更强。初步以ODn=2.5作为新型CEIA试验的Cutoff值区分新近感染和长期感染,其结果与BED试验结果符合率为85.2%(Kappa=0.698,P<0.01)。新方法还需要进一步优化和评价,包括设定新近感染阈值、研究适用于中国HIV感染人群的核心技术参数(窗口期、假新近感染率等)。结论:构建、表达了一种具有抗原性、可标记的重组抗原HIV-Ag-R03,初步建立了一种结合BED试验和亲和力试验优点的HIV-1新发感染检测新方法,新型捕获酶联免疫试验有待进一步优化和评价。