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肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,主要集中在发展中国家,西方国家由于HCV感染,肝癌发病率呈上升趋势。肝癌的发生机制还不完全清楚,但已知多种危险因素与肝癌发生相关。主要因素包括肝炎病毒感染,酒精性肝病,非酒精性脂肪性肝炎,氯乙烯,以及食品污染的黄曲霉毒素B1 (AFB1)等。已知乙型肝炎病毒的可以整合入宿主的DNA内,激活癌基因或者灭活抑癌基因致瘤；其余诱因主要是通过活性氧簇(ROS)的产生、细胞DNA损伤、内质网应激和肝细胞炎症损伤等来诱导肝癌的发生发展。虽然肝癌是一种高度血管化的肿瘤,但是首先肿瘤血管在功能上是不完整的,它会导致肝癌组织缺血、缺氧、坏死。其次肝癌往往发生在有慢性肝病基础的患者身上,特别是有肝硬化背景的患者(检查发现70%-90%的肝癌患者有肝硬化背景)。肝纤维化肝硬化,压迫阻碍正常肝脏血流供应,导致组织缺氧。此外肝脏肿瘤的发展迅速,必然导致氧供应和消耗之间的不平衡,造成局部组织缺氧。所以缺氧在肝癌组织中普遍存在。缺氧诱导因子HIF-1A在缺氧环境下表达增高,在肿瘤的发生发展、侵袭转移、化疗耐药等方面都有非常重要的作用。本课题组前期采用激光捕获显微切割(LCM)和基因芯片技术相结合,研究伴与不伴肝外转移肝癌原发瘤之间基因表达谱的差异,发现了以高尔基体跨膜糖蛋白GP73为首的一组候选基因,可能在肝癌转移过程中起到重要作用,有望成为肝癌转移的重要干预靶点。GP73是一个73 kD的高尔基体跨膜糖蛋白,首先在成人巨细胞性肝炎(GCH)的患者体内分离出来。随后的研究显示肝细胞GP73蛋白在HBV/HCV感染,酒精或自身免疫性疾病,肝硬化中表达显著增高。GP73表达增高的模式提示,在肝细胞的各种急、慢性损伤过程中GP73的表达均增高。进一步的研究表明,GP73在HCC患者的血清和切除标本中也表达升高。尽管GP73作为肝癌的血清诊断标志物仍存在争议,但是有文章证明,它的高表达与预后不良相关,尤其是与转移存在密切关系。有文章证明GP73与sCLU在高尔基体有共定位和相互作用,sCLU是一种分泌性蛋白,与细胞应激状态和肿瘤发生发展密切关系。一项研究将小鼠GP73基因的C-末端进行截短突变来对其功能进行研究,观察到小鼠肝细胞明显发生小泡性脂肪性肝炎。类似的变化可以在人类脂肪肝疾病中观察到,这种组织病理学的变化与氧化应激和线粒体功能障碍有关。总而言之,可以推论,GP73在肝损伤应激环境上调,参与到氧化应激,线粒体应激,肿瘤的发生、转移过程中。基于以上背景,本文首先证明了GP73可以通过稳定HIF1A的表达,促进肿瘤的侵袭转移。其次证明GP73可以通过稳定HIF1A促进肿瘤细胞对Sorafenib耐药。进一步实验证明各种肝损伤都会导致肝细胞的缺氧应激状态是GP73表达增高的主要原因。HIF1A则是缺氧应激环境下促进GP73表达增高的主要分子。GP73与HIF1A形成正反馈环路,促进肿瘤恶性进展。第一部分GP73促进肝肿瘤细胞的侵袭转移能力目的：探讨缺氧应激环境下表达增高的GP73对肝肿瘤细胞侵袭转移能力的影响。方法：通过慢病毒介导的RNA干扰／过表达技术,我们构建了GP73稳定过表达细胞株PLC/PRF/5-LV-GP73及对照细胞株PLC/PRF/5-LV-EV;GP73稳定干扰细胞株MHCC97H-sh-GP73及对照细胞株MHCC97H-sh-NT。采用Matrigel侵袭实验,探究GP73在缺氧和常氧环境下对肝肿瘤细胞侵袭转移能力的影响。并通过Western Blot技术验证GP73在缺氧和常氧环境下对肝肿瘤细胞EMT转化相关指标的影响。采用裸鼠原位移植瘤模型验证GP73对肝肿瘤侵袭转移能力的影响。通过Matrigel侵袭实验证明HIF1A在GP73促进肝肿瘤侵袭转移中起到的关键作用。最后通过Western blot, qRTPCR,免疫荧光等实验技术探究GP73对BIF1A表达的影响。结果：常氧及缺氧环境下PLC/PRF/5-LV-GP73细胞侵袭转移能力均较对照PLC/PRF/5-LV-EV细胞显著增强(p<0.01)。常氧及缺氧环境下MHCC97H-sh-GP73细胞侵袭转移能力均较对照MHCC97H-sh-NT显著减弱(p<0.01)。MHCC97H-sh-GP73细胞在缺氧和常氧环境下均表现出向上皮转化的特性,细胞间黏附加强,成团生长,Western Blot检测发现E-cadherin表达明显上调,Vimentin表达明显下调；PLC/PRF/5-LV-GP73细胞在缺氧和常氧环境下均表现出EMT转化,E-cadherin表达明显下调,Vimentin表达明显上调。体内实验证明过表达GP73组裸鼠肺转移率(83.3% vs 33.3%)与转移瘤的级别(Ⅲ～Ⅳ vs Ⅰ～Ⅱ)均高于对照组;干扰GP73组裸鼠肺转移率(16.7% vs 83.3%)与转移瘤的级别(Ⅰ vs Ⅱ～Ⅲ)的低于对照组。有文献表明HIF1A在常氧及缺氧环境下均可以影响细胞的侵袭转移能力,那么有没有可能是GP73影响了HIF1A蛋白的表达进而影响肿瘤细胞侵袭转移能力。进一步研究发现,GP73在常氧与缺氧环境下均可以影响HIF1A蛋白的表达水平,但HIF1A转录本的表达变化不明显。我们发现PLC/PRF/5-LV-GP73细胞在缺氧和常氧环境下干扰HIF1A后细胞侵袭转移率均较对照显著降低(p<0.05,p<0.01),细胞发生MET转化,E-cadhrin表达明显上调,Vimentin表达明显下调,证实GP73通过稳定HIF1A促进细胞发生EMT转化,进而增强肿瘤的侵袭转移能力。此外,免疫荧光共聚焦结果显示,GP73部分定位于线粒体内,缺氧及常氧环境下MHCC97H-sh-GP73细胞ROS产生较对照细胞下降,PLC/PRF/5-LV-GP73细胞ROS产生较对照细胞增加,差异有统计学意义(p<0.05)。最后通过HIFA蛋白半衰期检测实验发现,PLC/PRF/5-LV-GP73细胞HIF1A蛋白半衰期明显长于对照组(57.3min vs 34.8min),细胞内PHD2/PHD3表达也明显低于对照组,进一步证明GP73通过影响ROS的产生增强HIF1A蛋白的稳定性。结论：GP73通过影响HIF1A蛋白的稳定性促进肝肿瘤细胞的侵袭转移能力。第二部分GP73影响肝肿瘤细胞对Sorafenib的敏感性目的：探讨GP73对Sorafenib敏感性的影响,进一步阐明GP73通过影响HIF1A蛋白的稳定性,影响肝肿瘤细胞对Sorafenib的敏感性。方法：运用细胞毒性实验,体外验证在缺氧及常氧环境下GP73对Sorafenib药物敏感性的影响。将GP73稳定干扰或过表达的细胞株注射入裸鼠皮下成瘤,1周后开始服用Sorafenib,动态观察肿瘤大小及体积变化,体内验证GP73影响肝癌细胞对sorafenib的敏感性。结果：体外实验证明,常氧环境下MHCC97H细胞干扰GP73后对sorafenib的敏感性增强(P<0.05)。缺氧环境下,MHCC97H细胞对Sorafenib的敏感性减弱(p<0.05),干扰GP73后细胞恢复对Sorafenib的敏感性。常氧环境下,PLC/PRF/5细胞过表达GP73后对sorafenib的敏感性减弱(p<0.05),缺氧环境下过表达GP73的PLC/PRF/5-LV-GP73细胞对Sorafenib的敏感性较对照PLC/PRF/5-LV-EV显著减弱(p<0.01)。有研究表明,缺氧环境下HIF1A的表达可以使肿瘤细胞对Sorafenib产生耐药。结合本文第一部分,GP73可能是通过促进HIF1A蛋白表达来影响肿瘤细胞对Sorafenib的敏感性。进一步实验发现在缺氧及常氧环境下PLC/PRF/5-LV-GP73细胞干扰HIF1A后,恢复对了Sorafenib的敏感性(p<0.01),验证了我们的假设。文献报道,Sorafenib可以抑制HIF1A的表达,缺氧环境下,PLC/PRF/5-LV-GP73细胞在Sorafenib的作用下HIF1A蛋白下降的速率较对照组细胞PLC/PRF/5-LV-EV慢,在药物浓度为2.5μm和5μm时最为显著。体内实验证实,Sorafenib对MHCC97H-sh-GP73细胞来源的皮下肿瘤抑瘤率为80.1%,高于对照组细胞MHCC97H-sh-NT 52.2%;对PLC/PRF/5-LV-GP73细胞的抑瘤率为40.02%,低于对照组细胞PLC/PRF/5-LV-EV 63.3%,结论：GP73通过稳定HIF1A的表达,抑制肝肿瘤细胞对Sorafenib的敏感性。第三部分GP73在缺氧应激环境下受HIF1A调控表达增高目的：探讨GP73在肝硬化、慢性炎症以及各种肝损伤情况下表达升高的机制。明确肿瘤的缺氧应激环境可以使GP73表达增高。方法：运用COCL2、缺氧培养箱对肝肿瘤细胞造成缺氧应激状态,通过实时荧光定量PCR技术和Western-Blot技术检测肝肿瘤细胞中GP73转录及蛋白水平的表达情况。进一步通过慢病毒介导的RNA干扰／过表达技术,验证HIF1A在缺氧应激引起GP73表达增高中起到的作用。最后采用分泌型的Gaussia荧光素酶测试系统验证GP73启动子上缺氧反应原件的活性,证明HIF1A能否通过结合GP73启动子上的缺氧反应原件,上调GP73转录本的表达。结果：在COCL2(200μM)、1%O2培养环境下,MHCC97H、Hu7、PLC/PRF/5、Hep3B细胞GP73的转录及蛋白表达水平均增高。在缺氧应激环境下干扰HIF1A, GP73的转录及蛋白表达水平均不增高。进一步通过分泌型的Gaussia荧光素酶测试系统检测证实,HIF1A通过结合GP73启动子的缺氧反应原件,上调GP73转录本的表达。结论：GP73在缺氧应激的环境下表达增高,这一现象受HIF1A调控。