在细胞内,各种生物分子之间的相互作用,对于调节、维持细胞的正常生长、发育、繁殖具有非常重要的意义。F?rster或荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)是一种物理现象,需要在一对分子之间发生非辐射能量转移,这取决于距离以及光子从供体到受体荧光色团的发射和再吸收。这种能量转移的效率高度依赖于供体和受体荧光团的选择,荧光蛋白是最流行的荧光色团之一,可以与不同的蛋白质分子形成融合蛋白,有机荧光色团可用来标记目标核酸序列。FRET技术可以用来分析蛋白质之间相互作用,以及蛋白质与其他分子之间的相互作用。PUF蛋白家族是一种高度保守的蛋白,属于广泛的真核细胞RNA结合蛋白家族,它们通过与靶标m RNA的3’非翻译区(UTR)结合并调节其降解来调节靶标m RNA的生命周期。不同的PUF蛋白具有称为RNA结合支架或PUF蛋白结构域的特异性结合位点,可调节靶RNA的表达。在长期进化过程中,PUF蛋白的结合特异性,调控和靶标等在真核生物中出现了多样化现象。科学家已经分析出PUF蛋白氨基酸序列与识别核苷酸序列的对应关系,为人工设计PUF蛋白并应用于识别结合特定RNA序列奠定了基础。在本研究中,我们首先通过绿色荧光蛋白序列基因的64、65、66和72位的定点突变设计了一种新的蓝绿色荧光蛋白mutCFP,并分析了其发射光谱。此mutCFP在490nm波长处产生一个单峰发射光谱,这与普通青色荧光蛋白在476nm和500nm波长处具有双峰发射光谱有所不同,mutCFP可作为FAM荧光色团FRET的荧光供体。构建PUF3-mutCFP融合蛋白表达载体,并纯化融合蛋白,分析其与目标核苷酸的互作。PUF3蛋白可以结合12个寡核苷酸(GATCGGCAGCGA),我们在其编码序列的3’端连接mutCFP编码序列,并在大肠杆菌胞内表达此融合蛋白。经分离、纯化获得此融合蛋白PUF3-mutCFP。我们设计、合成在6-FAM标记与PUF识别位点之间有不同长度腺苷酸的寡核苷酸链,并以融合蛋白PUF3-mutCFP中的mutCFP作为荧光供体,6-FAM作为荧光受体进行FRET分析。结果我们发现与15、20和25个腺苷酸相比,当FAM和靶序列之间有9个连接腺苷酸时,PUF3与目标寡核苷酸具有最高亲和力(K_d=163.3 nM)。而与6、8和10个寡核苷酸相比,PUF3对12个寡核苷酸靶序列具有最高亲和力(K_d=44.3 nM)。用FRET技术进一步研究了pH,甘油和还原剂对PUF3和目标寡核苷酸链互作的影响。通过解离常数测定分析,发现PUF3和目标寡核苷酸链的亲和力受到这些因素的影响,且在pH8,20%甘油和2 m M DTT的条件下具有更强的亲和力。本研究利用FRET技术分析PUF3与目标寡核苷酸链的互作条件,如6-FAM标记与PUF识别位点之间间隔核苷酸链长度的影响,并评估不同pH、甘油和还原剂等对其相互作用的潜在影响。总之,本研究建立了一个RNA结合蛋白与目标核苷酸链互作的互作分析体系,为体外分析其生物大分子之间的互作、深入探究它们体内的互作功能建立的一定基础。