非特异性脂转移蛋白与植物耐逆性的相关性研究

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陆生植物的气生器官的表皮覆盖着一层由蜡质形成的脂膜,它主要由长链疏水物质组成的,这些物质是特长链脂肪酸的衍生物。表皮蜡质的物理化学性质决定它在植物的生活史中起着重要的作用。作为物理屏障蜡质可以限制非气孔性失水、抵御过量紫外线照射引起的损伤、抵抗细菌和真菌等病原菌的入侵。目前对于蜡质的合成和调节途径还没有定论,已经提出许多模式用来解释蜡质的合成与运输途径。一般认为蜡质前体是在质体中合成并在内质网中延伸成特长链脂酰辅酶A,合成的特长链脂酰辅酶A通过四种不同的途径转化成蜡质组成成分。内质网、转运小泡、配体物质、膜泡受体和其它分泌因子可能参与了蜡质组成成分从细胞内到达表皮的运输过程。已有证据表明植物体内的非特异性脂转运蛋白参与了蜡质的运输。 非特异性脂转运蛋白是一类分子量较小的可溶性碱性蛋白质,许多研究表明在体外它能结合并跨膜运输磷脂、糖脂和脂肪酸等物质。已经分离出许多物种的非特异性脂转移蛋白,其一级和高级结构均已阐明。不同物种的非特异性转移蛋白具有很高同源性,它们是碱性的富含半胱氨酸的蛋白质,在N端有一个信号序列,8个保守的半胱氨酸残基能形成4个二疏键以维持蛋白的空间结构,推测在其空间结构的中心形成了一个能容纳脂类物质的洞穴,但在体内还不知道nsLTP的配体包括哪些物质,对于nsLTP能否在体内能够结合并转运脂类还没有明确的定论。此外nsLTP在植物体内广泛存在并由一个基因家族编码,由于它能结合和转运脂类物质,因此推测它可能参与植物体内许多不同的生理过程,如转运蜡质的角质单体到表皮细胞外侧,作为抑菌蛋白抵抗病原菌的入侵以及花粉和柱头的识别等。另外发现nsLTP对各种胁迫有很强的反应,干旱、温度的变化和盐渍化等非生物胁迫都能诱导其表达量的增加。目前认为nsLTP是定位在细胞壁中的一类蛋白质,没有直接的证据表明它能体内跨膜转运脂类物质,尽管猜测它可能参与多种生理过程,但对于其具体的生物学功能仍不清楚;另外,由于nsLTP在不同组织和不同发育阶段的特异性表达以及各个nsLTP之间是否存在功能上的互补都为准确确定其功能增加了难度。 通过对小盐芥的cDNA文库大量测序,在1000个EST序列中获得14个编码Th-nsLTP的序列,这表明它是一个中等丰度的基因。测得Th-nsLTP序列全长为634bp,含有一个 非特异性脂转移蛋白与植物耐逆性的相关性研究编码 112个氨基酸的阅读框架,N端的23个氨基酸组成一段信号肽序列,表明它可能和分泌有关。通过软件分析发现小盐芥的nsLTP和其它植物的nsLTP无论在一级结构还是空间结构上都有很高的同源性。Southern杂交表明它在基因组中以单拷贝的方式存在。N。帅e_分析表明小盐芥的nsLTP在不同盐浓度和不同盐处理时间下表达量明显高于对照;ABA、PEG、低温和高温都能诱导Th-nsLTP的表达,这表明Th-nsLTP参与了小盐芥对抗各种胁迫的反应。为了验证它在体内的功能构建了过量表达载体和反义表达载体,利用花浸染法把农杆菌携带的双元表达载体,吓011:乃代d工P和优AM***3301:Th们sLTP以及PCAMBTA3301:antiTh代SLTP转入拟南芥和小盐芥。通过多次筛选己经获得了转基因拟南芥的纯合植株,同时也获得了反义表达h-nsLTP的T;代转基因小盐芥。对获得的转基因植株的表型分析发现,在过量表达nsLTP的转基因拟南芥中蜡质晶体结构有一定程度的变化,但变化不是十分的显著。反义表达Th-nsL TP的小盐芥蜡质变化程度比较明显,其中有两株转基因小盐芥由于缺少蜡质在常规培养条件下几乎不能正常生长,并且严重缺少叶绿素,另外几株蜡质晶体结构明显发生了改变,并且叶面皱缩,对缺水敏感。这些结果表明 Th-nsL TP的确参与了小盐芥表皮蜡质的分泌过程,并能影响表皮蜡质的总量和晶体结构。
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