胰腺癌是由胰腺上皮细胞恶化形成的消化系统恶性癌症,是恶型肿瘤中最常见的肿瘤之一,其致死率在我们排名第四。胰腺癌发病机制到现在为止仍然不太清楚,目前只有吸烟是引起病因的直接证据。因为胰腺癌发病初期没有明显的症状,等到有黄疸等表型时候往往已经是患病中晚期,所以造成治疗相对困难,再加上胰腺癌还具有有恶性程度高,转移、浸润程度强的特性,造成胰腺癌的治疗更加困难,其5年的生存率更是低至不到5%。BRSK2是由我们实验室最早克隆出来的一个基因,刚开始认为其只在脑中表达,故起名为脑特异表达激酶2(Brain-specific kinase 2,BRSK2),后来发现其不仅仅存在于脑里,在胰腺中也有表达。我们实验室早期的工作发现,BRSK2基因在胰腺导管癌细胞PANC-1中有特异性高表达,进一步研究证明BRSK2基因是PANC-1细胞耐受糖饥饿的重要因子,其在糖饥饿这一恶劣条件下的表达量和活性均有上调。BRSK2调节PANC-1对恶劣环境的耐受是因为糖饥饿条件下过量表达的BRSK2可以通过磷酸化TSC2从而负调控MTOR通路,抑制蛋白合成；并且过量表达的BRSK2还可以使细胞阻滞在G2/M期,从而在周围环境转好之前延缓细胞分裂。我们知道胰腺导管癌细胞对恶劣环境有很强的耐受性能,这种耐受性是其难以得到治疗的重要原因之一,而已有的实验结果证明,BRSK2基因是胰腺导管癌对恶劣环境有强耐受性的重要因子,组织芯片的结果进一步证明了BRSK2在胰腺癌中的特异性高表达,那么其在胰腺导管癌治疗中是否能起到一定作用,其是否能作为化疗的辅助方式或者是作为治疗胰腺导管癌的药物靶点,我对此进行了初步研究。我们采用消减PANC-1细胞内源BRSK2基因,联合使用其他化疗药物的方法检测BRSK2是否能够引起PANC-1细胞对化疗药物的敏感性增强。采用慢病毒载体构建了稳定消减BRSK2基因的PANC-1细胞株,并选择治疗肿瘤的化学药物处理该细胞株,发现稳定消减BRSK2基因的PANC-1细胞在一定浓度的柔红霉素、阿霉素、丝裂霉素以及雷帕霉素等药物的处理下,其存活率要远远小于对照组细胞株,并且比对照组细胞株有更小的IC50值；之后通过使用两个有效的消减片段瞬时消减PANC-1细胞BRSK2基因,使用上述化疗药物处理细胞,发现消减BRSK2细胞使’ANC-1在阿霉素、柔红霉素、丝裂霉素以及雷帕霉素内质网是真核生物的一个十分重要的细胞器,是真核生物蛋白质折叠的场所,同时是新合成的多肽进行修饰以形成正确的三级结构的场所。当生理变化造成细胞内质网中的蛋白不能被正常处理的时候,内质网压力(ER stress, ERs)就会通过激活下游相应通路最终激活未折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR),UPR以此来保护细胞免受损伤。ERs和UPR与许多疾病的发生都有关系,如糖尿病、缺氧条件下的肿瘤、神经退行性疾病和脑缺血等。VCP(vasolin-containing protein)在哺乳动物中又被称为P97,是与多种细胞活性相关的三磷酸腺苷酶超家族(ATPases associated with various cellular activities, AAA family)中的一员,又称黑色素转铁蛋白,其相对分子质量为97.2KDa。VCP参与细胞内许多蛋白通路,在ERs条件下中,VCP经由参与内质网关联的蛋白降解(endoplasmic reticulum-associated degradation, ERAD)降解中间未正确折叠的蛋白产物来调控ERs。BRSK2是我们实验室首先报道的基因,关于其研究主要集中在神经极化以及突触形成、细胞周期调控等方面。我们实验室前期研究表明BRSK2是胰腺导管癌细胞PANC-1在耐受糖饥饿这一恶劣生存条件的重要因子。但是关于其在ERstress中起到的作用尚未涉及。我们在这里首先报道,BRSK2在ERs的药物处理下可以被激活,表现为BRSK2蛋白水平和转录水平的增高。并且其定位也发生了变化,由弥撒状分布在细胞中变成了成团状,并且能够与ER蛋白Herp共定位。而在消减掉BRSK2的HeLa细胞中加入ERs药物刺激之后,HeLa细胞的凋亡细胞与对照相比有了显著增多。已有的报道指出,AMPK家族的另外一个成员SIK2,能够经由活化 VCP/P97活性来调控ERAD。那么作为同为AMPK家族成员的BRSK2是否也能够通过调控VCP的活性参与到ERs激活的相关生物通路过程中呢?为了确定研究的细胞模型我们选取多株细胞,检测了内源VCP的表达,发现VCP在细胞系中为广谱性表达,其中在多株肝癌细胞以及胰腺癌细胞PANC-1中的表达量较高。而胰腺癌细胞PANC-1同时有内源性BRSK2的表达,因此我们选择胰腺癌细胞PANC-1作为内源研究的工具细胞。(见Supp data)首先体内体外相互作用实验证明了两者之间有相互作用关系,之后,为了确定BRSK2究竟是通过和VCP的哪个区域互相作用来发挥功能的,我们根据vcp激酶活性区域,构建了表达VCP片段蛋白的原核表达载体,GST-pulldown实验证明,除了D1区域之外,BRSK2与VCP的其他三个区域均有互作现象,其中与N端的结合最为紧密；随后在外源表达了VCP的HeLa细胞中,我们发现VCP和BRSK2在细胞质有共定位的现象,并且这种定位在衣霉素、毒胡萝卜素等ERs药物作用下发生变化,由弥散变得成团,随后的进行的CD-3δ蛋白稳定性的研究进一步支持了该结论。总之,我们发现在ERs条件下,BRSK2能够被激活,并且消减BRSK2之后。在ERs药物刺激下能够引起HeLa细胞凋亡显著增多,这种现象的产生可能是由于BRSK2与VCP这一ERs调节因子互作所引起的。处理下生长受到了显著抑制。在另一株同样有内源BRSK2基因表达的胰腺癌细胞株Miapaca-2上我们也得到了相似的结果。采用流式细胞仪检测细胞凋亡的方式,我们发现,消减BRSK2的胰腺癌细胞PANC-1以及Miapaca-2,在低剂量的阿霉素(0.5 μ M)处理下,细胞凋亡程度与对照组细胞相比显著增高。结合前面已经获得的分子机制研究,我们认为,这种对药物敏感性的增强是因为对于P53功能缺陷的PANC-1以及MIAPACA-2胰腺癌细胞株而言,面对化疗药物阿霉素这一DNA损伤因素,细胞在缺失BRSK2的时候,唯一的一条正常功能的G2/M周期检验点被打乱,细胞无法以周期阻滞的方式完成我修复,最终造成细胞对化疗药物的敏感性增强。自噬是生命体在生理和病理过程中常见的一种现象,由药物引起的自噬往往会导致胰腺癌细胞的凋亡甚至死亡。我们实验证明,雷帕霉素能够引起胰腺癌细胞PANC-1自噬程度的增强,而消减BRSK2可以使PANC-1细胞由雷帕霉素引起的自噬程度增强,但是消减BRSK2并未引起ROS的变化,说明BRSK2并未通过影响ROS参与到自噬过程。最后我们尝试使用AMPK的抑制剂AMPKI联合使用常用的治疗胰腺癌化疗药物Gemcitabine来替代siRNA。我们发现,胰腺导管癌细胞PANC-1的生长在联合使用AMPKI以及Gemcitabine时受到了抑制,但是在动物模型上的用药造成了裸鼠死亡,解剖死亡裸鼠发现其体内的肝脏、胃、肠等器官均出现了变黑现象,我们认为是化合物AMPKI的毒性过大,因此认为其不适合用作药物。总之,通过消减BRSK2基因,我们发现胰腺癌细胞对阿霉素、柔红霉素、丝裂霉素C以及雷帕霉素等化疗药物的敏感性增强,这种增敏性可能由于BRSK2对周期的调控所引起；消减BRSK2的胰腺导管癌细胞无法启动DNA损伤检验点进行自我修复,最终造成其对化疗药物敏感性增强。