结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是一类危害严重的常见消化道恶性肿瘤。虽然目前我国人民的生活水平和医疗条件都得到了很大的提升,但由于社会发展带来的环境问题以及人们生活习惯和饮食结构的改变,结直肠癌的发病率依然呈现上升的趋势。目前对于结直肠癌早期诊断和治疗的研究虽然取得了很大进展,但对于晚期结直肠癌的治疗还没有取得令人欣慰的成果,这部分患者的生存并没有得到根本的改善,死亡率依旧居高不下。因此,深入研究结直肠癌的发生、发展和转移的机制,积极寻找新的分子标志物,对结直肠癌的预防、早期诊断和个体化治疗以及患者生存质量的提升均具有重要的意义。结直肠癌的发生发展是一个极其复杂的过程,它的形成机制目前还不十分清楚。我们实验室一直以结直肠癌为疾病模型研究肿瘤发生发展机制及筛选诊断预后标志物；2010年我们通过差异分泌蛋白质组学研究,发现生长分化因子15(Growth differentiation factor 15, GDF15)是结肠组织中高特异性表达的一个分泌蛋白,并且它在淋巴结转移灶细胞株SW620的培养上清及细胞裂解液中的表达显著高于来源于同一结直肠癌病人的原发灶细胞株SW480。这些结果提示,GDF15可能在结直肠癌的发生、发展中起到重要的作用。鉴于此,我们实验室在随后的工作中对GDF15在结直肠癌中的作用开始了一系列的研究。GDF15是转化生长因子(transforming growth factor, TGF-β)超家族成员,定位于19号染色体的p13.11上。我们的前期研究显示,结直肠癌患者血清中的GDF15水平明显高于正常人群,而且有淋巴结转移的病人又高于无转移的病人。mRNA水平也发现GDF15在结直肠癌组织中表达明显比正常组织高。免疫组织化学结果证实,有淋巴结转移的结直肠癌病人的癌组织GDF15表达水平明显高于无转移的患者。这些结果都表明,GDF15与结直肠癌的发生发展密切相关,可以作为结直肠癌转移的标志物。但GDF15在结直肠癌中的转移机制以及它对预后的影响仍不清楚。本课题在上述研究工作基础上,发现不同结直肠癌细胞GDF15 CDS (coding sequence)区第604位碱基存在C和G的不同,经查阅相关资料,发现这是一个单核苷酸多态性位点(rs1058587)。我们进一步对结直肠癌患者的肿瘤组织和其配对正常组织该位点进行检测,发现部分病人的基因型存在不一致的情况,比如肿瘤组织的基因型为CG,而其配对正常组织的基因型为CC。鉴于这种基因型差异的现象发生在同一个病人的肿瘤组织和配对正常组织之间,所以我们认为GDF15rs1058587不仅是一个多态性位点,而且还存在突变。rs1058587位于基因组的编码序列上,它编码的GDF15蛋白成熟体第六位氨基酸发生了组氨酸(H)和天冬氨酸(D)的转换,因此又叫H6D多态性,该位点的突变称之为H6D突变。这种GDF15 H6D多态性或其突变必然会导致GDF15蛋白质结构甚至功能发生改变。基于上述工作基础,我们设想,H6D多态性与结直肠癌的发生是否存在易感性?H6D多态性及其突变是否会影响到GDF15的表达,是否与转移和预后等临床病理特征存在某种联系?GDF15引起结直肠转移的机制又是什么?本课题的研究目的就是要解决上述这些问题。1.GDF15表达与结直肠癌转移和预后的关系以及转移机制的探讨我们运用免疫组织化学方法对250例结直肠癌患者肿瘤组织中GDF15蛋白表达水平进行了检测。结果证实GDF15的表达与淋巴转移、远处转移、TNM分期以及肿瘤芽数目正相关,并且GDF15高表达的患者预后差。我们体外模拟旁分泌途径,运用人重组GDF15蛋白对结直肠癌细胞株HT29、SW480及LS513进行处理来探讨GDF15引起结直肠癌转移的机制。通过Transwell实验证实,GDF15能够促进HT29细胞和SW480细胞的迁移。在随后进行的信号通路实验中,我们发现,GDF15能使HT29和SW480细胞Smad2/3和磷酸化的smad2/3蛋白水平表达增加。并且,在HT29和LS513细胞中,Twist和MMP9蛋白表达升高,E-cadherin蛋白表达下降；在SW480细胞中,Twist、MMP9和Vimentin蛋白表达升高,E-cadherin蛋白表达下降。以上结果表明,GDF15促进结直肠癌细胞的迁移是通过EMT (Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT)过程来实现的。为了进一步验证Twist等EMT标志物表达的改变是否受Smad2/3的调控,我们运用shRNA干扰技术在HT29细胞和SW480细胞中敲低Smad2或Smad3的表达后,GDF15引起EMT标志物表达改变的效应能够被逆转。该结果说明GDF15引起EMT标志物表达的改变是受Smad2/3调控的。GDF15是TGF-β超家族成员,而TGF-β是目前最常用于诱导EMT模型的细胞因子,这种诱导作用是通过激活Smad2/3来实现的。当我们用GDF15作用于细胞后,Smad2/3也被激活。因此,我们设想,GDF15是否也是通过TGF-β通路参与了EMT过程,并引起细胞的迁移。为了验证这种假设,我们运用TGF-β受体特异性抑制剂SB-431542预处理HT29、SW480及LS513细胞后,再用GDF15作用这些细胞,结果Smad2/3的表达没有增高,E-cadherin的表达也没有出现下降。另外,我们在SB-431542处理后的HT29和SW480细胞中用GDF15作用后,磷酸化Smad2/3的表达末见增高。这些结果说明GDF15引起EMT标志物表达的改变是通过Smad依赖的TGF-β信号通路来完成的。2. GDF15 H6D多态性及其突变在结直肠癌临床中的意义我们运用焦磷酸测序的方法对250例结直肠癌患者的肿瘤组织和配对正常组织DNA以及198例正常人群血液DNA的GDF15 H6D多态性位点进行检测,对获得的数据与临床病理特征及预后情况进行综合分析,结果显示：(1)H6D多态性及其突变与GDF15的表达未见明显相关性。(2)GDF15 H6D多态性与结直肠癌的发生存在相关性,含有D等位基因的人群是结直肠癌发病的易感人群。(3)结直肠癌中,GDF15 H6D存在突变,这种突变在CG基因型中更容易发生,有突变的患者死亡率比没有突变的患者要高。(4)在男性结直肠癌中,GDF15 H6D发生突变的患者容易发生远处转移,且预后差。(5)在结肠癌患者中,GDF15 H6D含D等位基因的患者容易发生远处转移,这类患者死亡率高,纯合的HH基因型预后好。(6)在直肠癌患者中,有H6D突变的患者容易引起淋巴结转移和高的TNM分期,最后导致死亡的比例增高。综合以上GDF15在结直肠癌转移中的分子机制探讨和GDF15表达、H6D及其突变在临床中的意义的研究,我们得出以下结论：GDF15促进结直肠癌的转移,其表达与患者的预后相关,表达高预后差。GDF15通过活化TGF-β信号通路,促进肿瘤细胞发生EMT,从而促进转移。GDF15 H6D多态性位点及其突变与结直肠癌的发生、发展相关。D等位基因是结直肠癌的易感基因,并且与结肠癌远处转移正相关,D等位基因的病人预后差。GDF15 H6D多态性位点在肿瘤病人中可以存在突变,该突变与男性结直肠癌远处转移正相关。