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目的:细胞毒素相关蛋白A(Cag A)是幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)的重要毒力因子,与胃腺癌的发生密切相关。本研究在已证实Cag A与胃黏膜上皮细胞YWHAE蛋白具有相互作用的前提下,应用cag A野生株与缺失突变株的对比实验,验证Cag A对细胞功能的影响,进而在此基础上探讨Cag A与YWHAE相互作用对胃黏膜上皮细胞迁移的影响,旨在进一步阐明Hp Cag A的致病机制。方法:1.Cag A及YWHAE在细胞定位上的验证:通过Hp NCTC 11637标准株感染AGS细胞和SGC7901细胞后,分别采用Cag A及YWHAE的特异性抗体处理细胞,用激光共聚焦显微镜观察Cag A和YWHAE在细胞中的定位。2.构建NCTC 11637 cag A基因缺失株NCTC 11637Δcag A:采用基因敲除同源重组原理,构建带卡那霉素抗性标志的cag A缺失突变质粒,电击转化到NCTC 11637标准株中,用卡那霉素筛选出NCTC 11637Δcag A,用PCR和Western blot技术鉴定cag A基因的缺失及Cag A蛋白的表达情况,将NCTC 11637△cag A连续传25代进行cag A基因缺失遗传稳定性的鉴定。3.NCTC 11637 Cag A对SGC7901细胞生物学功能的影响:将NCTC 11637和NCTC 11637Δcag A以MOI(Bacterium/Cell)=100分别感染SGC7901细胞,进行以下实验:Hp感染细胞5天,每天用MTS法检测细胞的增殖,细胞增殖率=OD2-5d/OD1d;Hp感染细胞48h,用流式细胞仪分别检测细胞凋亡及细胞周期;划痕划线法检测细胞迁移情况:Hp感染细胞6h后,对细胞进行划痕划线处理,用Carl Zeiss License Activation Tool对细胞进行拍照测量划痕宽距,48h后观察细胞迁移情况,细胞迁移距离=6h划痕宽距-48h划痕宽距。4.构建YWHAE过表达及沉默的AGS细胞及SGC7901细胞:将本实验室已构建好的YWHAE真核表达质粒p CMVTNT-YWHAE及YWHAE si RNA分别通过转染试剂Lipofectamine 2000及X-treme GENE si RNA transfection reagent转染AGS及SGC7901细胞,48h后分别进行Western blot验证YWHAE蛋白的表达情况及YWHAE si RNA的干扰效果。5.Cag A和YWHAE的相互作用对细胞迁移功能的影响:将本实验室已构建好的Cag A真核表达质粒p CMVTNT-cag A,通过转染试剂Lipofectamine 2000转染AGS及SGC7901细胞,48h后进行Western blot的验证;用不同浓度的p CMVTNT-cag A及p CMVTNT-YWHAE分别转染AGS及SGC7901细胞,采用划痕划线法检测细胞的迁移情况;选择适当浓度的p CMVTNT-cag A及p CMVTNT-YWHAE(或YWHAE si RNA)共转染AGS和SGC7901细胞,同法检测细胞迁移情况。6.统计学分析:采用SPSS20.0进行独立样本t检验、单因素方差分析、析因设计方差分析进行数据统计。结果:1.通过细胞免疫荧光共定位,可以在AGS细胞及SGC7901细胞的胞浆中观察到Cag A与YWHAE同时存在,表明了Cag A与YWHAE能共定位于AGS细胞及SGC7901细胞浆中。2.经PCR、Western blot鉴定成功构建了NCTC 11637 cag A基因缺失株,并经连续传25代,证明获得了可稳定遗传的NCTC 11637Δcag A。3.NCTC 11637 Cag A对细胞生物学功能影响的验证(1)细胞增殖方面:细胞培养至第3-5天,NCTC 11637组细胞增殖速率大于NCTC11637Δcag A组,经统计学分析,第3天及第5天有显著性差异(P<0.05);(2)细胞凋亡方面:细胞凋亡率NCTC 11637组(1.82%)较NCTC11637Δcag A组(2.55%)低(P<0.01);(3)细胞周期方面:NCTC11637组G1期、S期、G2期细胞百分数分别为60.77%、25.4%、13.04%,NCTC11637Δcag A组G1期、S期、G2期细胞百分数分别为56.78%、28.27%、13.95%,经统计学分析,两组间在各期内比较有显著性差异(P<0.05);(4)细胞迁移方面:NCTC 11637组细胞迁移距离(147.39μm)较NCTC11637Δcag A组细胞迁移距离(81.65μm)大(P<0.05)。4.构建YWHAE过表达及沉默的AGS及SGC7901细胞通过Western bolt验证,AGS及SGC790细胞中YWHAE蛋白的表达量:p CMVTNT-YWHAE组高于阴性对照p CMV-TNT组,YWHAE si RNA组低于阴性对照无关si RNA组(NC组)。5.Cag A与YWHAE的相互作用对细胞迁移的影响(1)通过Western bolt验证,在AGS及SGC790细胞中Cag A蛋白的表达量:p CMVTNT-cag A组高于阴性对照p CMV-TNT组。(2)在AGS及SGC7901细胞中均可观察到:a.随着p CMVTNT-cag A浓度的增高,细胞迁移距离逐渐增加;而随着p CMVTNT-YWHAE浓度的增高,细胞迁移距离逐渐减少;b.共转p CMVTNT-cag A、p CMVTNT-YWHAE后:细胞迁移距离CMV-YWAHE<CMVTNT<Cag A+YWHAE<CMV-Cag A,经统计学分析,有显著性差异(P<0.05);c.共转p CMVTNT-cag A、YWHAE si RNA后:细胞迁移距离CMV-YWAHE+NC<CMVTNT+YWHAE si RNA<Cag A+NC<Cag A+YWHAE si RNA,经统计学分析,有显著性差异(P<0.05)。结论:1.空间定位证明Cag A和YWHAE可在细胞内相互作用。2.NCTC 11637 Cag A能够促进胃上皮细胞增殖、抑制细胞凋亡、将细胞周期阻滞于G1期,并促进细胞迁移。3.细胞YWHAE蛋白能够减弱Cag A促细胞迁移的作用。