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Zwittermicin A（ZwA）是苏云金芽胞杆菌和蜡样芽胞杆菌产生的一种氨基多元醇类抗生素,化学式C13H28N6O8。它对植物的某些真菌性病原菌有抑制作用,可以增加苏云金芽胞杆菌晶体蛋白的杀虫效率。其生物合成基因簇仅部分序列被克隆,合成途径未知。推测认为ZwA是以L-Ser、丙二酰辅酶A、氨基丙二酰-ACP、羟基丙二酰-ACP和2,3-二氨基丙酸（Dap）为前体物组装而成的。本研究以产ZwA的苏云金芽胞杆菌菌株YBT-1520为实验材料,构建了菌株YBT-1520的全基因组细菌人工染色体（BAC）文库。文库包含1536个转化子,插入片段大小48.5-74.5 kb。若菌株YBT-1520的基因组以6Mb计算,文库共覆盖基因组22.37倍,每1kb大小的基因出现几率超过99.9%。以已经公布的与ZwA合成相关的16 kb的DNA序列为出发点,通过PCR扩增筛选文库,构建覆盖ZwA合成基因簇的重叠联合群,重叠联合群共覆盖102 kb的区域。结合末端测序和菌株YBT-1520基因组测序,从而获得苏云金芽胞杆菌菌株YBT-1520 ZwA生物合成基因簇。杂交结果显示该基因簇位于菌株YBT-1520的染色体上。基因簇大小67 kb,包括30个开放阅读框。除去已经报导的16 kb的序列所包含的8个基因,67 kb的基因簇还包含1个聚酮合成酶基因orf1和3个非核糖体肽合成酶基因orf3、orf4、orf5,合成前体物Dap的基因zwa5A、zwa5B,修饰酶氨甲酰基转移酶基因c,转录后调控因子磷酸泛酰巯基乙胺转移酶基因zwa9,转运负责基因zwa7A、zwa7B。同源性比较显示ZWA5A和ZWA5B蛋白分别是半胱氨酸合成酶和鸟氨酸环化脱氨酶的同源物。通过同源交换插入,获得zwa5A基因的缺失突变体zwa5A。该突变体不再产生ZwA,用化学合成的D/L-Dap添加到突变体zwa5A-的发酵生长过程中,则突变体zwa5A-可以恢复产ZwA。这说明zwa5A基因对ZwA的产生是必需的;在ZwA的产生过程中,化合物D/L-Dap可以替代zwa5A基因的功能。通过pGEX-6P-1载体,在大肠杆菌中超量表达了ZwA生物合成基因簇中的腺苷酰化结构域ZWAA。依赖于ATP的焦磷酸交换实验表明,腺苷酰化结构域ZWAA2可以特异性识别并活化Dap。上述结果证实,Dap是ZwA生物合成的直接前体物之一。根据已有的假设结合本研究的实验结果,推导出ZwA的合成途径:以L-Ser、丙二酰辅酶A、氨基丙二酰-ACP、羟基丙二酰-ACP和Dap为前体物通过非核糖体肽合成酶/聚酮合成酶/非核糖体肽合成酶的杂合途径聚合成未成熟的ZwA,然后释放、氨甲酰基化修饰变成成熟的ZwA。根据结构与基因的对应关系,ORF1催化L-Ser非核糖体肽延伸单元的起始和丙二酰辅酶A聚酮延伸单元的延伸,ORF2催化氨基丙二酰-ACP以及羟基丙二酰-ACP两个聚酮延伸单元的延伸,ORF3催化Dap非核糖体肽延伸单元的延伸。从L-Ser到丙二酰辅酶A是非核糖体肽到聚酮的杂合,属于Ⅰ型杂合（同一个合成酶分子内完成杂合）,从羟基丙二酰-ACP到Dap是非核糖体肽到聚酮的杂合,属于Ⅱ型杂合（两个合成酶分子间完成杂合）。本研究还调查了高丝氨酸内酯酶基因Aii在ZwA产生菌株蜡样芽胞杆菌UW85、UW56中的表达情况以及它对ZwA产量的影响。Western杂交和高效液相色谱检测结果表明,Aii基因在UW85和UW56中可以顺利表达,并且不影响ZwA的产量。这说明ZwA高产菌株UW56有潜力开发成一种通过ZwA和高丝氨酸内酯酶联合抗病的基因工程菌。