【研究背景】　　在世界范围内，肺癌已经成为发病率和致死率最高的肿瘤，只有10％的患者在确诊肺癌后能生存5年或以上【1】【2】。近年来，我国肺癌的发病人数和死亡人数一直呈上升趋势，高于世界平均水平。肺癌病理类型可分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌两种，非小细胞肺癌约占肺癌总数中的80%【3】【4】。尽管目前的诊疗水平有着很大的提高，但仍有约2/3的患者在就诊时就已经处于晚期,因而化疗还是晚期肺癌患者主要的治疗方式，然而对化疗药物耐药成为患者治疗过程中的难　　题【22】-【24】。　　miRNA是一类单链小分子非编码RNA,一般由18-25nt组成。主要参与转录后基因调控，机制主要是与目标基因的mRNA中的3’端非编码区域结合，抑制目标mRNA翻译，并将其降解。【8】【11】越来越多的研究表明，miRNA在多种癌症的发生发展中起到重要的作用。对肿瘤细胞的增殖、凋亡以及化疗药物耐药现象均有影响【15】【17】。我们在前期课题的基因芯片的结果中，发现A549表达谱和A549/DDP表达谱之间存在大量的miRNA表达异常，其中包括miR-17-92家族以及let-7b。目前许多文献证实，miR-17-92家族为原癌基因，能够促进癌症的发生发展，let-7b则为抑癌基因，能够抑制癌症的发生【12】-【14】。　　近年来，有文献报道miRNA不仅仅存在于细胞内【18】【20】，还广泛稳定的存在于各种体液环境中，如血液、唾液以及尿液。肿瘤患者血液中miRNA可通过肿瘤细胞凋亡或者囊泡释放进入血液系统，形成循环miRNA。越来越多的研究证实，循环miRNA可用于肿瘤的早期诊断，预后判断以及治疗效果分析【21】-【24】。　　【研究目的】　　探讨miR-17、miR-92a、let-7b对非小细胞肺癌顺铂耐药的影响和意义。　　【研究方法】　　1.细胞体外培养：培养包括A549及其耐药株A549/DDP，耐药细胞株需要DDP维持。　　2.以A549及其耐药株A549/DDP为细胞研究对象，培养并提取细胞总RNA，RT-PCR检测miR-17、miR-92a及let-7b在细胞中的表达水平。　　3.细胞转染：在A549中转染miR-17模拟物，miR-92a模拟物，let-7b抑制物；在A549/DDP中转染miR-17抑制物，miR-92a抑制物，let-7b模拟物。　　4.细胞毒性试验：将A549和A549/DDP加入顺铂维持培养，使用cck8试剂检测细胞存活情况。　　5.细胞克隆平台实验：将A549和A549/DDP单细胞悬液接种在6孔板中，培养1周后，甲醇固定并染色，观察细胞增殖情况。　　6.流式细胞检测：将A549和A549/DDP单细胞悬液接种在6孔板中，转染并且加药维持培养，当细胞长满时，消化成单细胞悬液，离心、漂洗后染色上机分析细胞凋亡情况。　　7.循环miRNA检测：收集病人血液样品，进行离心收集血浆，再对血浆样品进行循环miRNA提取，逆转录，以及RT-PCR。　　8.统计学方法：采用SPSS13.0以及GraphPadPrism6软件进行统计分析，实验数据以均数±标准差表示，组间比较采用t检验分析。检验水准α=0.05。P<0.05为差异有统计学意义。　　【研究结果】　　1.RT-PCR检测miR-17、miR-92a以及let-7b在细胞中表达情况：　　RT-PCR检测miR-17、miR-92a以及let-7b在A549与A549/DDP中的表达水平，结果显示,miR-17、miR-92a在A549/DDP中的表达水平高于其在A549细胞中的表达水平，而let-7b在A549/DDP中的表达水平低于其在A549细胞中的表达水平。　　2.miR-17、miR-92a以及let-7b对细胞顺铂耐药的影响：　　细胞毒性实验显示：A549转染miR-17模拟物，miR-92a模拟物以及let-7b抑制物后，与阴性对照组相比，对顺铂的敏感性下降（P<0.05）；而A549/DDP转染miR-17抑制物，miR-92a抑制物以及let-7b模拟物后，与阴性对照组相比，对顺铂的敏感性增加。（P<0.05）　　3.miR-17、miR-92a以及let-7b对细胞增殖的影响：　　细胞克隆平台实验结果显示：A549转染miR-17模拟物，miR-92a模拟物以及let-7b抑制物后，与阴性对照组相比，细胞形成克隆集落数多于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；而A549/DDP转染miR-17抑制物，miR-92a抑制物以及let-7b模拟物后，与阴性对照组相比，细胞形成克隆集落数少于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。　　4.miR-17、miR-92a以及let-7b对细胞凋亡的影响：　　A549转染miR-17模拟物，miR-92a模拟物以及let-7b抑制物后，与阴性对照组相比，细胞凋亡率低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；而A549/DDP转染miR-17抑制物，miR-92a抑制物以及let-7b模拟物后，与阴性对照组相比，细胞凋亡率高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。　　5.RT-PCR检测循环miR-17、miR-92a以及let-7b在NSCLC患者血浆中表达情况与临床相关性：　　RT-PCR检测循环miR-17、miR-92a、let-7b在NSCLC患者血浆中表达情况，结果显示，循环miR-17、miR-92a在含铂化疗耐药组的表达量高于含铂化疗敏感组的表达量，循环let-7b在含铂化疗耐药组的表达量低于含铂化疗敏感组的表达量。（P<0.05）。ROC曲线分别显示三者曲线下面积为0.689（0.524-0.854），0.691（0.528-0.853），0.697（0.532-0.862），三者P值均大于0.05。　　【结论】　　1、miR-17、miR-92a表达量升高，let-7b表达量下降，可以促进A549和A549/DDP增殖，抑制其凋亡以及出现对顺铂耐药现象。　　2、循环miR-17、miR-92a高表达，let-7b低表达与NSCLC含铂化疗耐药有一定的临床相关性，有可能作为提示含铂化疗耐药的潜在生物标志物。