论文部分内容阅读
缺氧（hypoxia）是指因组织的氧气供应不足或用氧障碍,导致组织的代谢、功能和形态结构发生异常变化的病理过程。大量研究表明,缺氧可导致心室重塑。心室重塑的病理学特征为心肌细胞肥大、心肌成纤维细胞增殖、间质纤维化、心肌细胞死亡等。人们对慢性长期缺氧加速心室重塑的细胞与分子生物学机制进行了深入系统的研究,部分揭示了缺氧导致心肌结构重构、电重构的病理生理学机制。大量证据表明,代谢重构（亦称代谢重编程）在缺氧引发心室重塑中发挥重要作用,但目前缺氧造成代谢重构的确切机制尚不十分清楚。microRNA（miRNA）是一种非编码的小RNA,它调控基因的转录后表达。研究证明,有多种miRNAs在心室代谢重塑中起重要作用。miR-155作为miRNA家族的一员,已被报道参与调控心血管疾病的炎症反应,调控血管重塑。但miR-155在缺氧引起的心肌代谢重塑的分子机制还未被报道,本研究着重对miR-155在心室代谢重塑中的作用及其分子机制做了初步研究。第一部分慢性缺氧诱导的心代谢重塑模型构建目的:研究慢性缺氧引起的心脏结构和功能改变。方法:1.心脏超声检测正常小鼠与缺氧小鼠心功能变化。2.心脏HE染色观察正常与缺氧小鼠心脏组织学改变。3.天狼星红染色及心脏组织的α肌动蛋白（α-actin）和胶原蛋白I型α2链（Col1a2）免疫双荧光染色观察两组小鼠心脏内胶原含量变化。4.实时定量PCR（qRT-PCR）、Western Blot检测葡萄糖转运蛋白-1（GLUT1）的表达变化。5.液质联用方法检测心脏组织中乳酸和丙酮酸含量。结果:1.慢性缺氧诱导小鼠心肌肥厚与正常小鼠相比,缺氧后小鼠心率加快,左室收缩、舒张末期内径减小,心功能减弱,室壁厚度增加。2.慢性缺氧导致心肌细胞形态异常心脏HE染色结果显示,缺氧后小鼠心肌细胞发生肿胀,空泡样变增加,心肌间隙增加,说明缺氧造成心肌损伤。3.慢性缺氧导致心肌纤维化心脏内胶原含量的多少可以反映心脏纤维化情况。天狼星红染色及胶原蛋白I型α2链免疫荧光实验均显示小鼠缺氧后心脏组织内胶原含量增加,说明缺氧诱导心肌纤维化。4.慢性缺氧促进心肌组织摄取葡萄糖葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）是葡萄糖转运的主要载体,可间接代表葡萄糖摄取情况。qRT-PCR、Western Blot及免疫荧光染色均显示,缺氧小鼠心脏中GLUT1的表达明显增加。5.慢性缺氧促进心肌组织糖酵解进程液质联用方法检测正常与缺氧小鼠心脏组织中丙酮酸和乳酸含量,结果显示,缺氧后小鼠的心脏组织中丙酮酸和乳酸含量增加,说明缺氧诱导葡萄糖的利用并促进有氧氧化转变为糖酵解。小结:慢性缺氧诱导心室结构改变,促进心脏组织的糖酵解。第二部分miR-155介导缺氧诱导的心肌成纤维细胞代谢重编程目的:探讨miR-155在慢性缺氧诱导的心肌成纤维细胞代谢重编程中的作用及其分子机制。方法:1.MTT检测缺氧对心肌成纤维细胞增殖的影响。2.葡萄糖摄取实验检测缺氧对心肌成纤维细胞葡萄糖摄取的影响。3.Western Blot检测常氧组和缺氧组细胞GLUT1的表达。4.液质联用方法检测正常与缺氧细胞培养基中丙酮酸及乳酸浓度。5.Real-time PCR检测缺氧后细胞内miR-155的表达。6.qRT-PCR检测缺氧对miR-155WT与miR-155-/-小鼠心肌成纤维细胞GLUT1、丙酮酸脱氢酶激酶1、丙酮酸激酶2、己糖激酶的表达的影响。7.糖原染色检测缺氧对miR-155WT与miR-155-/-小鼠心肌成纤维细胞糖原积累的影响。结果:1.慢性缺氧促进小鼠心肌成纤维细胞增殖原代小鼠心肌成纤维细胞,分别进行常氧和缺氧处理,MTT结果显示,缺氧促进小鼠心肌成纤维细胞增殖。2.慢性缺氧促进心肌成纤维细胞摄取葡萄糖葡萄糖摄取实验显示,慢性缺氧促进心肌成纤维细胞摄取葡萄糖。另外,缺氧组GLUT1的mRNA和蛋白的水平也显著增加,提示缺氧促进细胞对葡萄糖的摄取和转运。3.慢性缺氧促进心肌成纤维细胞糖酵解进程液质联用方法结果显示,缺氧的心肌成纤维细胞培养基中丙酮酸、乳酸浓度均增加,提示缺氧诱导葡萄糖的利用并由有氧氧化转变为糖酵解。为了进一步验证上述结论,我们检测了糖酵解代谢关键酶丙酮酸脱氢酶激酶1、丙酮酸激酶2、己糖激酶的表达。结果显示,缺氧显著诱导丙酮酸脱氢酶激酶1、丙酮酸激酶2、己糖激酶在心肌成纤维细胞中的表达。4.缺氧下调miR-155的表达为了进一步研究缺氧诱导心肌成纤维细胞代谢重编程的分子机制,缺氧培养原代小鼠心肌成纤维细胞,Real-time检测miR-155的表达,结果显示,缺氧显著降低miR-155在心肌成纤维细胞中的表达。5.敲除miR-155,促进心肌成纤维细胞增殖为了进一步明确miR-155在缺氧诱导的心肌成纤维细胞代谢重编程中的作用,我们缺氧培养miR-155WT和miR-155-/-小鼠心肌成纤维细胞,MTT检测miR-155对两组细胞增殖的影响,结果显示,缺氧显著诱导miR-155-/-组心肌成纤维细胞增殖。6.敲除miR-155,促进心肌成纤维细胞摄取葡萄糖为了进一步明确miR-155促进心肌成纤维细胞增殖是否与促进葡萄糖摄取有关,我们进一步检测了GLUT1的表达。结果显示,缺氧显著诱导miR-155-/-组小鼠心肌成纤维细胞组对葡萄糖的摄取。7.敲除miR-155,心肌成纤维细胞中糖原合成减少、糖酵解增强糖原染色结果证明,与对照组相比,miR-155-/-组在缺氧后糖原积累减少;qRT-PCR结果显示缺氧后,敲除miR-155促进丙酮酸脱氢酶激酶1、丙酮酸激酶2、己糖激酶等表达,提示敲除miR-155,心肌成纤维细胞糖酵解增强。小结:慢性缺氧促进心肌成纤维细胞增殖,下调心肌成纤维细胞中miR-155表达。敲除miR-155,促进慢性缺氧心肌成纤维细胞的增殖及糖酵解。结论:1.慢性缺氧下调miR-155在心肌成纤维细胞中的表达。2.敲除miR-155,促进缺氧诱导的心肌成纤维细胞代谢重编程。