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人肿瘤抑素(tumstatin)及血管生成抑制因子VT-ChPr的克隆、表达和活性分析生物化学与分子生物学博士生：顾取良指导教师：罗进贤教授人肿瘤抑素(humantumstatin，hTum)是Ⅳ型胶原蛋白α3链C端NC1区来源的28kD左右的片段，它能够通过与整合素αvβ3结合而诱导内皮细胞凋亡，抑制内皮细胞增殖，并显示出明显的抑制血管生成的作用，因而在肿瘤和其他血管异常增生性疾病的治疗中有应用潜力。
本文采用PCR技术从人胎肺cDNA文库中扩增了肿瘤抑素cDNA序列。将该cDNA克隆至载体pET-3c，获得的重组质粒pET-3c-tum转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)。SDS-PAGE结果显示，hTum在E.coliBL21(DE3，pET-3c-tum)中实现了非融合表达，将表达产物带从SDS-PAGE胶中切下回收目的蛋白，免疫新西兰大白兔获得ELISA效价高达1：1000的特异性兔抗人肿瘤抑素抗血清。将人肿瘤抑素cDNA克隆至酵母表达载体pPIC9k和pPICZαA，获得的重组质粒分别转化毕赤酵母GS115，构建毕赤酵母表达菌株GS115(pPIC9k-tum)和GS115(pPICZα-tum)。经SDS-PAGE和Westernblot分析，证明人肿瘤抑素(YhTum)获得分泌表达，表达量约25mg/L。将GS115(pPICZα-tum)的表达上清用SP-Sepharose离子交换层析纯化，产物纯度达到85％，并能明显抑制鸡胚CAM血管生成。
将人肿瘤抑素cDNA克隆至原核表达载体pET-15b，转化E.coliBL21(DE3)，实现了高效融合表达。融合表达产物(rhTum)经变性裂解和金属螯合亲和层析纯化后进行梯度透析法复性，得到了纯度高于92％的产物。纯化产物具有免疫反应活性，能显著抑制体外内皮细胞增殖和体内鸡胚CAM新生血管形成和小鼠黑色素瘤的生长。
为寻找抗血管生成和抗肿瘤活性更强的新候选分子，设计人肿瘤抑素66-99aa片段的34肽和钙网蛋白122-178aa片段的57肽通过Gly-Ser-Gly连接为嵌合重组蛋白VT-ChPr。将VT-ChPr基因克隆至质粒pET-15b，转化E.coliBL21(DE3)。SDS-PAGE结果显示，VT-ChPr蛋白在E.coliBL21(DE3，pET-VT)中获得了高效表达。表达产物经变性裂解和金属螯合亲和层析纯化，用稀释法复性，经分析最后产物纯度大于90％。纯化产物能够显著抑制内皮细胞增殖和鸡胚CAM新生血管形成，对小鼠黑色素瘤生长的抑制率达86.9％，表明VT-ChPr是一个活性较强的血管生成抑制因子，嵌合蛋白VT-ChPr的设计思路可行。