肝细胞癌是常见的恶性肿瘤之一。全世界45％的原发性肝癌发生在我国，位列我国癌症患者死亡原因第二位。其恶性程度很高，极易发生浸润转移，手术切除率低，手术疗效较差。即使是小肝癌(＜5cm)行根治术或肝脏移植术后，3年内复发率也高达50％以上。肝癌的治疗方法很多，包括早期切除、二期切除、经肝动脉栓塞化疗术(TACE)、局部消融(微波、射频等)及适形放疗、生物治疗、中药等综合治疗。目前经肝动脉化疗栓塞术(TACE)治疗肝癌已成为肝癌非手术治疗的首选方法，但其远期疗效仍欠理想，术后复发及转移发生率较大。如何提高TACE远期疗效，防止肿瘤进展，延长患者生存期是当前的主要研究目标。　　 目前研究证实导致TACE远期效果不理想的原因有：肿瘤坏死不彻底，血管新生，复发转移。研究表明在肿瘤对缺氧缺血反应中，HIF-1及VEGF发挥着重要的作用。　　 缺氧诱导因子-1(HIF-1)是缺氧条件下广泛存在于人体的一种转录因子，其可激活下游靶基因的转录，从而促进靶蛋白的生成并发挥调节作用，引起细胞对缺氧的一系列适应性反应如使细胞无氧酵解加强，促进肿瘤血管的新生并引起肿瘤自身的侵袭性增加和对放化疗的抗拒性增加。HIF-1作为转录因子，其靶基因有60余种，主要有血红素加氧酶和糖酵解酶等、VEGF、EPO、P53和血小板衍生生长因子β(PDGF-β)等。HIF-1由α亚基和β亚基组成，HIF-1的生理活性是由HIF-1α亚基的活性和表达决定的。　　 由此可见，HIF-1α在肝癌TACE术后残留、复发转移中发挥重要的作用，在分子水平沉默HIF-1α表达对提高TACE治疗肝癌的疗效具有极大的应用前景。　　 RNAi(RNA interference)是现阶段最新的基因技术，它是指通过人为地引入与内源靶基因具有相同序列的双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)，从而诱导内源靶基因的mRNA降解，达到阻止基因表达的目的。　　 目前的研究可以推断TACE联合RNAi技术抑制HIF-1α基因表达将为肝癌的综合治疗带来崭新的研究方向。　　 大鼠肝癌CBRH-7919细胞株来源于用二乙基亚硝胺(DENA)诱发的大鼠原发性肝癌，可分泌AFP，病理学上为肝细胞性肝癌，具有与肝细胞性肝癌相同的生物学特性。制作成功的大鼠肝癌模型，经体表超声检查可发现肝内有肿块存在，并且可进行介入操作，为动物实验的操作提供一个好的平台。　　 本课题研究利用CoCl2诱导大鼠肝癌CBRH-7919细胞株模拟TACE术后缺氧环境，并在模拟缺氧环境下利用HIF-1αsiRNA敲除HIF-1α基因从而抑制大鼠肝癌细胞模拟缺氧条件下HIF-1α及VEGF的表达，为下一步活体实验提供体外实验基础，为肝癌的综合治疗提供一种新的手段。　　 第一部分　　 目的：观察在不同浓度的CoCl2作用下大鼠肝癌CBRH-7919细胞株HIF-1α及VEGF在转录水平上各组表达的变化，建立理想的大鼠肝癌CBRH-7919细胞株体外模拟缺氧模型，探讨模拟缺氧条件下HIF-1α与VEGF基因表达的相关性。　　 方法：本部分采用CoCl2建立模拟缺氧模型。　　 1、检测大鼠肝癌细胞株CBRH-7919细胞株模拟缺氧模型中CoCl2合适药物浓度。　　 2、 MTT实验模拟缺氧条件下不同浓度CoCl2对大鼠肝癌细胞存活和生长的影响。　　 3、 realtime RT-PCR检测HIF-1α，VEGF的mRNA在模拟缺氧条件下不同时段大鼠肝癌CBRH-7919细胞株中的表达水平。　　 结果：　　 1、模拟缺氧12h条件下浓度为100μmol/L的CoCl2对大鼠肝癌细胞株CBRH-7919细胞株存活及生长无影响；浓度为150μmol/L，200μmol/L及300μmol/L,的CoCl2对大鼠肝癌细胞株CBRH-7919细胞株存活及生长有轻度抑制作用。模拟缺氧24h条件下浓度为100μmol/L及150μmol/L的CoCl2对大鼠肝癌CBRH-7919细胞株存活及生长无明显抑制作用;浓度为200μmol/L及300μmol/L的CoCl2对大鼠肝癌细胞株CBRH-7919细胞株存活及生长有明显抑制作用。　　 2、 realtime RT-PCR检测模拟缺氧条件下HIF-1α，VEGF的mRNA的表达情况。模拟缺氧24h，在不同浓度CoCl2作用下，HIF-1α，VEGF表达上调，以CoCl2浓度为200μmol/L上调最高，其次是浓度为150μmol/L组。　　 3、分析正常组与模拟缺氧组之间HIF-1α，VEGFmRNA表达的相关性，r=0.982，P＜0.05。　　 结论：　　 1、利用浓度为150μmol/L的CoCl2孵育24h制作的大鼠肝癌CBRH-7919细胞株模拟缺氧模型对大鼠肝癌细胞的生长影响无明显抑制作用，且HIF-1α，VEGF上调明显，能成功建立理想的体外大鼠肝癌CBRH-7919细胞株模拟缺氧模型。　　 2、模拟缺氧条件下大鼠肝癌CBRH-7919细胞株HIF-1α，VEGF表达明显上调，且两者之间呈正相关关系。　　 第二部分　　 目的：研究HIF-1αsiRNA对模拟缺氧状态下大鼠肝癌细胞HIF-1α及VEGF表达的影响，为HIF-1α基因干扰应用于动物实验提供依据。　　 方法：本部分采用CoCl2建立模拟缺氧模型。　　 1、根据HIF-1α基因序列设计三对HIF-1αsiRNA、一对阴性对照siRNA及一对阳性对照siRNA。　　 2、利用阳离子脂质体把FAM-siRNA转染入细胞，确保转染效率大于90％。　　 3、利用阳离子脂质体把HIF-1αsiRNA转染入细胞，模拟缺氧孵育24h后，realtime RT-PCR检测HIF-1α，VEGF的mRNA表达的变化。　　 结果：　　 1、在细胞汇合度为30％-50％情况下转染，siRNA的转染效率为90％-95％。　　 2、 realtime RT-PCR检测模拟缺氧条件下，转染siRNA入大鼠肝癌CBRH-7919细胞株后HIF-1α，VEGFmRNA表达情况，HIF-1αmRNA表达下降75％-80％，VEGFmRNA表达下降70％-75％。　　 结论：　　 1、模拟缺氧条件下转染HIF-1αsiRNA后，大鼠肝癌CBRH-7919细胞株HIF-1α，VEGFmRNA表达明显受抑制。HIF-1αsiRNA序列1是干扰效果明显的小干扰RNA。　　 2、筛选出一对能高效抑制HIF-1α表达的siRNA序列，为下一步动物实验提供实验依据。