实时荧光定量PCR监测黄瓜棒孢叶斑病方法的建立与应用

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黄瓜棒孢叶斑病是近年来在黑龙江省黄瓜种植区新流行的一种气传病害,在症状上易与黄瓜其他病害混淆,环境条件适宜时病菌潜伏期短、传播迅速,具有多次重复侵染,严重威胁着黄瓜生产。明确黄瓜棒孢叶斑病在黑龙江省的分布,并对病害进行快速、准确的鉴定及早期预测,对于病害的防治具有重要意义。本文对黑龙江省黄瓜棒孢叶斑病的发生情况调查,对疑似该病的致病菌进行形态学及分子生物学鉴定,建立并优化了黄瓜棒孢叶斑病菌的实时荧光定量PCR方法,对黄瓜棒孢叶斑病在黄瓜上的侵染动态与田间流行进行监测,得到以下结果:1.于2018-2019年调查了黑龙江省黄瓜主产区的黄瓜棒孢叶斑病发生情况,在调查的17个村中,只有齐齐哈尔的大民村、小花力村和大花力村没有发现黄瓜棒孢叶斑病,其他村均有危害;牡丹江和佳木斯地区发病率较高,平均病情指数达到25.8,而齐齐哈尔和哈尔滨地区发病率较低,平均病情指数为8.34。个别发病较为严重的地区为齐齐哈尔市的小五福马村、佳木斯的临江村和亨利村,病情指数分别为32.7、46.5和32.9。2.基于黄瓜棒孢叶斑病菌的肌动蛋白actin序列设计并合成了一对特异性引物CAF2(5’-GCCTCGAGCTGTTTTCCGTAAGT-3’)/CAR2(5’-CCGATCATGATACTGGCAGTGGTC-3’),以标准品构建实时荧光定量标准曲线并对实时荧光定量PCR反应体系进行了优化。最优体系为:退火温度为60℃、DNA模板量为3μL、引物量0.2μL(10 mmol·L-1)。此方法对黄瓜棒孢叶斑病菌DNA浓度检测下限为1.36×10-6ng·μL-1;对该体系进行组内与组间的重复性与稳定性检验,变异系数均小于2%。3.实时荧光定量PCR体系检测五种不同抗性黄瓜品种接种棒孢叶斑病菌后不同时间叶片中病菌的动态变化,得到在4 h-8 h(Cq值<30)时,黄瓜棒孢叶斑病菌开始侵染高感和感病品种,在8 h-12 h时开始侵染中抗、抗病和高抗品种,根据黄瓜棒孢叶斑病病情分级标准,当Cq值<21时,病情级别为1;Cq值<19时,病情级别为2;Cq值<17,病情级别为3;Cq值<14,病情级别为4。4.实时荧光定量PCR监测田间棒孢叶斑病的发生与流行。在监测期间,通过实时荧光定量PCR测得的大棚内孢子浓度与显微计数所得孢子个数的变化大致走向相似,说明了利用实时荧光定量PCR技术监测黄瓜棒孢叶斑病的可操作性。为更灵敏快速地预测预报黄瓜棒孢叶斑病提供新方法。
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