目的：糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病(diabetes mellitus,DM)最常见的慢性微血管并发症之一，也是导致终末期肾病最主要的原因之一，临床上以蛋白尿为主要表现。1型和2型DM均可发生DN，严重影响DM患者的生存质量和预后，因此，探讨DN的发病机制，寻求防治DN的有效方法具有重要意义。DN的发生发展是多种因素综合作用的结果，具有复杂的病理机制，尽管国内外学者不断探索DN的防治方法，但是到目前为止，仍然缺乏防治DN的特效方法。而中医药以其独特的辨证论治体系，多靶点的整体调节功能，以及三因制宜的个性化治疗方案，在临床防治DN中显示出巨大的潜力和广阔的应用前景。课题组将中医学的病因病机理论，尤其是络病理论，与多年的临床实践经验相结合，总结DN的基本病机为气阴两虚、血瘀阻络，选用黄芪、地黄、黄精、丹参、川芎、水蛭、地龙、全蝎等配伍组成益气养阴活血通络方，临床和早期实验表明该方治疗DN效果确切。本研究以高脂饲料饲养联合小剂量链脲佐菌素(STZ)腹腔注射复制DN大鼠模型，以益气养阴活血通络方对其干预，试图以足细胞为切入点，进一步验证该方的疗效，探讨该方对DN的作用机制，并比较该方与益气养阴活血方和益气养阴通络方的作用差别，探讨该方的组方配伍机制，以效测证，探讨DN的中医证候，为临床应用提供依据。方法：1益气养阴活血通络方对DN大鼠的肾保护作用健康雄性4～5周龄体重120g～150g SD大鼠55只，适应性饲养1周后随机选取10只作为正常对照组(normal control group, NG)，其余大鼠给予高脂饲料饲养。12周后高脂饲料饲养大鼠按30mg/kg腹腔注射STZ，NG注射相应体积枸橼酸缓冲液。72h后空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)≥16.7mmol/L为DM造模成功。成模大鼠按体重随机分为模型组(model group, MG)、益气养阴活血通络方治疗组(yiqi-yangyin-huoxue-tong-luo recipe ttreated group, YHTG)、益气养阴活血方治疗组(yiqi-yangyin-huo-xue recipe treated group, YHG)、益气养阴通络方治疗组(yiqi-yangyin-tong-luo recipe treated group, YTG)各10只，YHTG给予益气养阴活血通络方由(黄芪、地黄、丹参、川芎各2袋，黄精、地龙、水蛭、全蝎各1袋中药配方颗粒组成)1.00g/kg(相当于生药5.51g/kg)、YHG给予益气养阴活血方(由黄芪、地黄、丹参、川芎各2袋，黄精1袋中药配方颗粒组成)0.92g/kg(相当于生药4.65g/kg)、YTG给予益气养阴通络方(由黄芪、地黄各2袋，黄精、地龙、水蛭、全蝎各1袋中药配方颗粒组成)0.79g/kg(相当于生药3.87g/kg)，给药量按大鼠与人体型系数折算。NG及MG给予相应的凉开水，日1次灌胃，共32周。于给药第2周末(2W)、4W、8W、16W、32W代谢笼收集24小时尿液，测量大鼠的饮水量、饲料消耗量、尿量、体重，记录24h尿量，以3500转/分离心10分钟，取上清，-20℃保存。32W同时留取随机尿标本。ELISA法检测尿白蛋白浓度，尾静脉取血测FBG和糖化血红蛋白(HbA1c)后，水合氯醛麻醉大鼠，股动脉取血，分离血清，检测血肌酐(Scr)、尿肌酐、血脂三项(总胆固醇TC、甘油三酯TG、高密度脂蛋白胆固醇HDL)，称量肾脏重量。计算内生肌酐清除率(Ccr)、尿白蛋白排泄率(ACR)、肾脏指数(KI)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL)。留取肾皮质标本，行光镜和透射电镜检查，依据光镜切片测得的肾小球面积计算肾小球体积，从透射电镜图片上测量肾小球基底膜厚度。2益气养阴活血通络方对DN大鼠nephrin的影响ELISA法检测2W、8W、16W、32W24h尿白蛋白(U-alb)、24h尿nephrin(U-nephrin)和32W肾组织匀浆nephrin水平(K-nephrin)，分析U-alb和U-nephrin的相关性，以及32W U-alb、U-nephrin和K-nephrin的相关性，反转录酶多聚酶链反应(RT-PCR)检测肾皮质nephrin mRNA的表达。3益气养阴活血通络方对DN大鼠α-辅肌动蛋白-4(α-actinin-4)和足细胞密度的影响Western-blot和免疫组织化学法检测肾皮质α-actinin-4蛋白的表达，免疫组织化学法采用WT1C-末端标记足细胞核，计数单个肾小球内足细胞核数目，测量相应肾小球面积，计算足细胞密度，分析24h尿蛋白(U-pro)、α-actinin-4表达、足细胞密度之间的相关性。4统计学方法所有资料以±s表示，重复测量指标采用重复测量设计资料的单变量方差分析进行比较，各观察点进行组间两两比较；两组间比较采用t检验；多组间比较采用One-WayANOVA进行分析，两两组间比较采用LSD进行分析；变量间的相关性采用线性回归分析。所有数据分析应用SPSS16.0进行，以P<0.05为差异有显著性。结果：1益气养阴活血通络方对DN大鼠的肾保护作用1.1各组大鼠不同观察点FBG的比较与NG比较，MG和各治疗组FBG显著升高(P<0.05)；与MG比较，YHTG16W开始FBG升高显著改善(P<0.05)，YHG32W时FBG升高显著改善(P<0.05)，YTG FBG升高改善不明显(P>0.05)；治疗组间比较，各观察点FBG无显著性差异(P>0.05)。1.2各组大鼠不同观察点饮水量的比较与NG比较，MG和各治疗组饮水量显著增加(P<0.05)；与MG比较，YHTG2W开始饮水量增加显著改善(P<0.05)，YHG除4W、8W外其余观察点饮水量增加显著改善(P<0.05)，YTG从16W开始，饮水量增加显著改善(P<0.05)；治疗组间比较，各观察点饮水量无显著性差异(P>0.05)。1.3各组大鼠不同观察点饲料消耗量的比较与NG比较，MG和各治疗组饲料消耗量显著增加(P<0.05)；与MG比较，YHTG16W始饲料消耗量增加显著改善，YHG和YTG32W时饲料消耗量增加显著改善(P<0.05)；治疗组间比较，各观察点饲料消耗量无显著性差异(P>0.05)。1.4各组大鼠不同观察点尿量的比较与NG比较，MG和各治疗组尿量显著增加(P<0.05)；与MG比较，各治疗组尿量增加2W开始显著改善(P<0.05)；治疗组间比较，从8W开始，YHTG尿量显著少于YHG和YTG(P<0.05)。1.5各组大鼠不同观察点体重的比较造模前，高脂饲料组大鼠体重显著高于NG(P<0.05)；造模后，NG体重呈逐渐增加趋势，MG和各治疗组体重则逐渐下降；YHTG8W始，YHG和YTG32W时体重显著高于MG(P<0.05)；治疗组间比较，各观察点大鼠体重无显著性差异(P>0.05)。1.632W各组大鼠HbA1c、KI、Ccr、Scr、ACR的比较与NG相比，MG HbA1c、KI、Ccr、Scr、ACR显著升高(P<0.05)，各治疗组除Scr、YHG HbA1c、YTG KI外，其余指标也显著升高(P<0.05)；与MG相比，除YTG HbA1c下降不显著(P>0.05)外，各治疗组HbA1c、Ccr、Scr、ACR显著下降(P<0.05)，KI下降不明显(P>0.05)；治疗组间比较，YHTG对Ccr和ACR的影响大于YHG和YTG(P<0.05)，对HbA1c、KI和Scr的影响，治疗组间比较，差异不显著(P>0.05)。1.7各组大鼠血脂四项(TC, TG, HDL, LDL)的比较与NG比较，MG血脂四项显著升高(P<0.05)，各治疗组除TG升高不明显(P>0.05)外，TC、 HDL、LDL也显著升高(P<0.05)；与MG比较，各治疗组血脂四项升高显著改善(P<0.05)；治疗组间比较，血脂四项无显著差异(P>0.05)。1.8各组大鼠肾小球体积的比较与NG比较，MG和各治疗组肾小球体积显著增大(P<0.05)；与MG比较，各治疗组肾小球体积增大显著减轻(P<0.05)；治疗组间比较，肾小球体积无显著差异(P>0.05)。1.9各组大鼠肾小球基底膜厚度的比较与NG比较，MG和各治疗组肾小球基底膜厚度显著增厚(P<0.05)；与MG比较，各治疗组肾小球基底膜厚度增厚显著减轻(P<0.05)；治疗组间比较，肾小球基底膜厚度无显著差异(P>0.05)。2益气养阴活血通络方对糖尿病肾病大鼠nephrin的影响2.1各组大鼠不同观察点U-nephrin的比较与NG比较， MG各观察点、各治疗组2W、8W U-nephrin显著增加(P<0.05)；与MG比较，各观察点各治疗组U-nephrin增加显著改善(P<0.05)；治疗组间比较，各观察点U-nephrin无显著性差异(P>0.05)。2.2各组大鼠不同观察点U-alb的比较与NG比较，各观察点MG和各治疗组U-alb显著增加(P<0.05)；与MG比较，YHTG从2W始、YHG和YTG从8W始，U-alb增加显著改善(P<0.05)；治疗组间比较，2W、8W时YHTG U-alb显著低于YHG和YTG(P<0.05)。2.3MG不同观察点U-alb和U-nephrin相关性分析在各观察点，U-alb和U-nephrin呈正相关。2.4各组大鼠K-nephrin的比较与NG比较，MG和YHG K-nephrin显著下降(P<0.05)，YHTG和YTGK-nephrin下降不明显(P>0.05)；与MG比较，各治疗组K-nephrin下降明显改善(P<0.05)；治疗组间比较，K-nephrin无显著差异(P>0.05)。2.5MG大鼠32W末U-alb与U-nephrin、K-nephrin的相关性分析U-alb和U-nephrin呈正相关(r=0.828,P=0.006)，U-alb和K-nephrin呈负相关(r=-0.845,P=0.004)，U-nephrin和K-nephrin呈负相关(r=-0.991,P=0.000)。2.6RT-PCR检测各组大鼠肾皮质nephrin mRNA表达与NG比较，MG和各治疗组nephrin mRNA表达显著下降(P<0.05)；与MG比较，各治疗组nephrin mRNA表达下降显著改善(P<0.05)；治疗组间比较，nephrin mRNA表达无显著差异(P>0.05)。3益气养阴活血通络方对糖尿病肾病大鼠α-actinin-4蛋白表达及足细胞密度的影响3.1Western-blot检测大鼠肾皮质α-actinin-4的表达与NG比较，MG、YHG和YTG肾皮质α-actinin-4的表达显著下降(P<0.05)，YHTG肾皮质α-actinin-4的表达下降不明显(P>0.05)；与MG比较，各治疗组肾皮质α-actinin-4的表达减弱显著改善(P<0.05)；治疗组间比较，YHTG大鼠肾皮质α-actinin-4蛋白的表达明显高于YHG和YTG(P<0.05)。3.2免疫组织化学法检测大鼠肾皮质α-actinin-4的表达与NG比较，MG、YHG和YTG肾皮质α-actinin-4的表达显著下降(P<0.05)，YHTG肾皮质α-actinin-4的表达下降不明显(P>0.05)；与MG比较，各治疗组肾皮质α-actinin-4的表达减弱显著改善(P<0.05)；治疗组间比较，YHTG大鼠肾皮质α-actinin-4蛋白的表达明显高于YHG和YTG(P<0.05)。3.3各组大鼠足细胞密度的比较与NG比较，MG和各治疗组足细胞密度显著减小(P<0.05)；与MG比较，各治疗组足细胞密度减小显著改善(P<0.05)；治疗组间比较，足细胞密度无显著差异(P>0.05)。3.4各组大鼠U-pro的比较与NG比较，MG和各治疗组U-pro显著增加(P<0.05)；与MG比较，各治疗组U-pro增加显著改善(P<0.05)；治疗组间比较，YHTG U-pro显著低于YHG和YTG(P<0.05)。3.5MG大鼠U-pro、肾皮质α-actinin-4/β-actin、足细胞密度的相关性分析U-pro和α-actinin-4/β-actin呈负相关(r=-0.846,P=0.004)；U-pro和足细胞密度呈负相关(r=-0.844,P=0.002)；足细胞密度和α-actinin-4/β-actin呈正相关(r=0.815,P=0.007)。结论：1益气养阴活血通络方、益气养阴活血方和益气养阴通络方能显著减轻DN大鼠“三多一少”表现，改善DN大鼠脂代谢紊乱，降低DN大鼠ACR、U-pro和肾小球高滤过，减轻肾小球肥大和肾小球基底膜增厚，具有肾保护作用；2益气养阴活血通络方、益气养阴活血方可显著改善DN大鼠糖代谢紊乱，益气养阴通络方对糖代谢紊乱改善不显著；益气养阴活血通络方、益气养阴活血方、益气养阴通络方可减少DN大鼠尿nephrin的排出、抑制肾皮质nephrin蛋白和基因表达的下调、改善α-actinin-4蛋白的下调、减轻足细胞密度的下降，对DN足细胞有保护作用；3益气养阴活血通络方在降低ACR、减少U-pro、减少尿量、改善肾小球高滤过等方面明显优于益气养阴活血方和益气养阴通络方，可能与其改善α-actinin-4蛋白的下调优于益气养阴活血方和益气养阴通络方有关。