可控粒径磁性纳米颗粒制备及其在CNVs信息检测和靶向给药领域的应用

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磁性纳米颗粒(magnetic nanoparticles,MNPs)作为一种新型纳米功能材料在近几十年得到了迅猛的发展。其中磁性复合粒子成为了近年来生物材料领域的研究热点之一,它具有尺寸小、比表面积大、表面活性高、生物相容性好、流体稳定性好、比饱和磁化强度高及在外磁场作用下磁响应快速等一系列优良特性。磁性纳米粒子的应用不仅为功能材料的研究进展指明了新的方向,还为生物分离、生物信息提取和检测提出了新的思路,同时也为临床上的一些疑难杂症如各种癌症的治疗提供了新的路径。本论文的主要内容是通过溶剂热法制备两种不同结构(实心/空心)磁性纳米粒子。以实心磁性纳米颗粒为磁性载体结合磁分离技术、荧光检测手段、PCR(Multiplex polymerase chain reaction)技术及化学发光技术构建了引物延伸检测CNVs(Copy-number variants)信息的新方法。以空心磁性纳米颗粒为磁性载体,壳聚糖为骨架材料,肿瘤常用药5-氟尿嘧啶为模型药物,制备了5-氟尿嘧啶载药颗粒,建立了磁性靶向载药体系。具体内容包括:   1.溶剂热法分别制备实心/空心磁性纳米颗粒及pH值对产物的影响   采用经典的溶剂热法进行磁性纳米颗粒的制备,并对反应温度、反应时间、反应物用量、反应物分子量等可能影响产物的各项因素进行了探讨,实验结果表明这些因素对产物的大小、形貌等无显著影响。对比溶剂热法和共沉淀法制备磁性纳米颗粒的条件及其产物推测pH值对于磁性纳米颗粒的影响较大,并进行了实验验证。通过调节反应前溶胶液的pH值进行实验,对不同pH值条件下制备结果比较得到以下结论:pH值对产物粒径有显著影响——产物粒径随着反应前溶胶液的pH值的增加而明显的减小。通过调节pH值制备出一系列粒径不同、大小均匀、相貌良好的磁性颗粒,并对不同粒径的颗粒进行一系列表征,结果显示:   实心颗粒:粒径分析显示颗粒粒径最小为10 nm左右,最大约为600 nm。磁滞回归由线表征显示当颗粒粒径为300 nm左右时,其饱和磁性强度最大为84.26 emu/g,颗粒粒径为10 nm左右时,其饱和磁性强度最小仅为30.235 emu/g。   空心颗粒:粒径分析显示颗粒粒径最小为30 nm左右,最大约为600 nm。磁滞回归由线表征显示当颗粒粒径为600 nm左右时,其饱和磁性强度最大为71.523 emu/g,颗粒粒径为30nm左右时,其饱和磁性强度最小为55.663 emu/g。   为了使磁性纳米颗粒更稳定、更容易进行表面集团修饰,采用St(o)ber水解法在Fe3O4表面包被了SiO2壳,从而制备了磁含量较高的Fe3O4@SiO2复合磁性颗粒。由结果可知,制备出的复合颗粒表面SiO2壳不平滑但是包被均匀,具有明显的核壳结构,平均直径为600 nm大小比较均一,具有超顺磁性。   2.链霉亲和素复合磁性纳米颗粒生物信息提取能力验证   采用戊二醛法对Fe3O4@SiO2复合磁性颗粒进行链霉亲和素修饰制备Fe3O4@SiO2@S(A)复合颗粒,并对链霉亲和素在磁纳米颗粒表面的最大固定化容量进行探索。结果显示:实心颗粒链霉亲和素最大固定量为2.9μg/100μg;空心颗粒链霉亲和素最大固定量为2.3μg100μg。   采用荧光检测手段进行Fe3O4@SiO2@SA性能验证,用修饰有链霉亲和素的自制磁性颗粒对生物素荧光探针进行捕捉,并以商品化链霉亲和素颗粒进行对照,对其反应时间进行优化。自制链霉亲和素颗粒在反应5分钟后就基本达到平衡,对比商品化颗粒可以看出自制颗粒比商品颗粒反应更为迅速且反应效率更高。对生物素荧光探针浓度进行实验优化,发现实心链霉亲和素颗粒探针连接的饱和浓度为0.45μM,每毫克纳米颗粒表面寡核苷酸生物素探针的最大固定量为1800 pmol;空心链霉亲和素颗粒探针修饰的饱和浓度为0.25μM每毫克纳米颗粒表面寡核苷酸生物素探针的最大固定量为1000 pmol。以商品化链霉亲和素磁性纳米颗粒为对照实验,对比实验结果发现:自制磁性颗粒完全可以应用于生物信息挑取,且与商品化颗粒相对比其提取效果更好。   3.基于磁性纳米颗粒富集、生物素信号放大和化学发光技术的CNVs检测新方法的建立及应用   借助磁性纳米颗粒富集、生物素信号放大、PCR技术和化学发光检测技术的优势,建立了引物延伸检测CNVs新方法。将生物素探针通过链霉亲和素-生物素反应体系连接到链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒上,一次PCR循环扩增的DNA片段与修饰在MNPs上的探(链)杂交后进行化学发光定量检测,以相同体积去离子水代替扩增的DNA片段,其它组分相(同)的反应体系作为空白对照实验。检测结果发现一次PCR产物对应的化学发光强度为1470,空白实验对应的化学发光值为630,两者相差840。经过重复实验发现该实验具有较(强)的稳定性,结果显示一次引物延伸可以实现CNVs信息的高效检测和迅速定量。   4.载药空心磁性纳米颗粒制备及其缓释实验   采用5-氟尿嘧啶为模型药物、戊二醛为交联剂、壳聚糖为骨架材料,空心磁性纳米颗粒为磁性材料,通过乳化交联法制备了磁性纳米载药颗粒,构建了磁性靶向载药系统,(应)对载药颗粒进行表征、分析。表征结果显示载药后的磁性纳米颗粒与裸磁颗粒相比,颗粒表面结构有较大的变化。表面成分分析也显示了载药前后C元素含量的变化:Fe3O4中C元素的原子百分比为4.78%,载药后Fe3O4@CS@5-Fu中C元素的原子百分比为15.05%。()滞回归表明载药颗粒的磁性仍然较强,含磁量较高,其饱和磁化强度为37.888 emu/g。()定了载药颗粒的药物包封率和载药率,分别为21.60%,30.19%。24 h内,包封药物后的(磁)性颗粒在pH值为7.4的PBS缓冲液中可以连续释放85%以上的药物,并且释药达平衡的时间较长,曲线持续非常平稳,由此可以说明该空心磁性颗粒在药物缓释方面有明显的作用。
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