论文部分内容阅读
多巴脱羧酶(dopa decarboxylase,DDC)是儿茶酚胺(catecholamines,CAs)生物合成途径中重要的酶之一,可分别催化L-多巴和L-5-羟色氨酸合成两种重要神经递质多巴胺(dopamine,DA)和血清素(serotonin,5-HT)。DA和5-HT在动物体内具有关键作用,可调控生殖、发育、行为及免疫等多种生理过程。昆虫DDC可参与其黑化及蜕皮反应过程。此外,还与体色建成、发育及生命周期长短的调节等生命活动有关。蜕皮激素受体(ecdysone receptor,EcR)是唯一已知配体的核受体,其配体为蜕皮激素(ecdysteroid hormones,EH),EcR与超气门蛋白(ultraspiracle protein,USP)组成异源二聚体EcR/USP后,与EH结合形成配体受体复合物,三者相互作用启动蜕皮级联反应途径,从而调节昆虫变态发育及生殖等生命活动。雌激素相关受体(estrogen-receptor related receptor,ERR)是孤儿核受体,可参与雌激素信号途径,在疾病诊断及能量代谢调控中发挥作用。研究表明昆虫DDC的表达受到EH调控,并与EcR具有一定相关性。实验室先前探究表明拟黑多刺蚁EcR与ERR之间存在相关性。以上研究提示DDC可能与EcR、ERR之间存在相关性,但尚未被证实。拟黑多刺蚁(Polyrhachis vicina Roger,P.vicina 隶属于昆虫纲(ClassInsecta),膜翅目(Hymenoptera),蚁科(Fomicidea),群居生活,具有社会性,成虫具有多型现象,社会行为复杂,是研究昆虫生殖及行为调控等生命活动的优良材料。本实验以拟黑多刺蚁(P.vicina)为研究对象,通过原位杂交,Western-blot、免疫组织化学技术从mRNA及蛋白水平分析PvDDC在P.vicina不同发育阶段、不同品级成虫中的表达情况;利用RNAi技术沉默PvDDC,观察统计干扰前后虫体表型变化,推测PvDDC对拟黑多刺蚁生长发育的调控作用;应用qRT-PCR、原位杂交、Western-blot、免疫组织化学技术从mRNA及蛋白水平探究PvDDC与PvECR、PvERR相关性,分析三者对P.vicina生长发育及品级分化的影响作用。研究结果如下:1、采用原位杂交技术对P.vicina成虫腹部PvDDC mRNA进行定位研究,结果表明PvDDCmRNA在腹部分布较为广泛,不同品级表达分布部位具有差异性。工蚁腹部受精囊及脂肪体中阳性反应最强,生殖腔边缘及内部颗粒中阳性反应较强;雄蚁腹部精巢中阳性反应最强,其次为贮精囊、射精管、脂肪体及精母细胞,附腺中阳性反应较弱;雌蚁腹部与卵子发生有关的分化期卵母细胞、卵黄形成期的卵母细胞及脂肪体中阳性反应较强。根据PvDDCmRNA在不同品级腹部定位结果推测PvDDC可能调控P.vicina生殖器官的发育及精卵发生等生理过程。2、采用Western-blot技术对P.vicina不同发育阶段及不同品级成虫全身PvDDC蛋白进行定量研究,分析表明,PvDDC蛋白的表达存在明显的发育阶段及品级差异性。从卵到3龄幼虫,PvDDC相对表达量呈逐渐上升趋势,到了 4龄幼虫,其表达量较3龄幼虫稍低,蛹期其表达量继续降低。蜕皮完成后,P.vicina分化为三个不同品级成虫雌蚁、雄蚁和工蚁,其中,PvDDC蛋白在雄蚁中表达量最高,工蚁次之,雌蚁最少。PvDDC蛋白在雄蚁全身的相对表达量是P.vicina 整个生命周期中表达最高的,工蚁较雄蚁有所降低,但还是高于其他发育阶段。推测这可能与PvDDC蛋白对P.vicina不同发育时期调节作用相关,不同品级成虫PvDDC蛋白表达差异性可能与品级分化有关。3、采用免疫组织化学技术对P.vicina不同品级成虫脑部及腹部PvDDC蛋白进行定位研究,结果表明:PvDDC蛋白在成虫脑部阳性反应分布范围广。不同品级成虫脑部蕈形体中阳性反应最强,此外,工蚁脑部视叶、β叶、脑桥体及食道下神经节中阳性反应较强;雄蚁脑部视叶和视神经节层中反应强度较明显;雌蚁脑部侧前脑、脑桥体、中央复合体、α叶、β叶、中脑及咽侧体中阳性反应较强。推测PvDDC可能参与P.vicina神经系统的发育、学习记忆及复杂的社会行为。PvDDC蛋白在不同品级成虫腹部的定位研究结果与PvDDC mRNA水平相似,说明PvDDC在转录与翻译水平对P.vicina腹部发育的调控没有显著差异性。4、采用喂食法和浸润法介导的RNAi技术沉默PvDDC,观察统计虫体表型变化,结果表明:PvDDC-RNAi后,虫体体重下降、体长及头宽减少,畸形率及死亡率升高,幼虫生长发育严重受阻,蛹蜕皮延迟或蜕皮后虫体死亡,成虫腹部膨大及翅发育异常。这说明PvDDC对P.vicina正常生长发育有直接影响作用。5、采用qRT-PCR、原位杂交、Western-blot、免疫组织化学技术从mRNA及蛋白水平对PvDDC与PvECR、PvERR相关性进行探究。结果表明,PvDDC有效沉默后,引起不同发育阶段虫体PvEcR表达量均发生了明显下调,并且在统计学水平上组间具有极显著差异(P<0.01)。对PvERR表达量的影响较PvEcR的低,但在特定阶段依然变化明显。其中,三龄幼虫,蛹和雌蚁PvERR的表达具有明显下调作用,统计学分析表明差异极显著(P<0.01)。雄蚁PvERR的表达下调达到组间显著性差异(P<0.05),而工蚁PvERR表达没有明显变化。以上结果说明不同发育阶段虫体PvDDC与PvEcR具有相关性,且PvDDC干扰后对PvEcR的表达产生了显著的抑制作用,其对PvERR的影响作用虽然较小,但在特定的发育阶段及雄蚁也具有重要影响。推测PvDDC可能通过影响PvEcR的表达进一步间接影响PvERR的表达,三者共同作用调节不同发育时期P.vicina生长发育及成虫品级分化。本研究首次从蛋白水平对完全变态昆虫P.vicina的PvDDC蛋白进行定量及定位研究,更加直接的明确了 PvDDC对P.vicia生长发育的调控作用。通过RNAi技术对PvDDC进行了有效沉默,从表型变化了解了PvDDC对P.vicina生长发育的直接影响作用,从mRNA及蛋白水平探究了 PvDDC与PvEcR和PvERR相关性,为P.vicina品级分化调控机制的研究奠定了基础,为其它昆虫生长发育调控提供理论依据。