论文部分内容阅读
近年来的研究表明，中枢神经系统除神经元之外，神经元周围的胶质细胞（星形胶质细胞和小胶质细胞）在慢性疼痛的产生和维持中发挥着不可忽视的作用。胶质细胞在被激活的情况下，还能作为免疫反应细胞，产生一些信号分子，参与对神经元功能的调节。在胶质细胞产生的信号分子中，细胞因子（cytokines）和趋化因子（chemokines）是参与慢性疼痛调节的重要物质之一。本实验研究了脊神经结扎（SNL）后脊髓中趋化因子CXCL1在神经病理性疼痛中的作用及机制。方法：1.结扎小鼠的左侧L5脊神经（spinal nerve ligation, SNL）诱发神经病理性疼痛模型。2.用行为学检测来判断小鼠的机械性触诱发痛和热痛觉过敏的程度。3.用Real-time PCR法检测CXCL1mRNA和TNF-α mRNA的表达。4.免疫荧光染色检测CXCL1、GFAP、OX-42、IBA1、CXCR2、pERK、c-Fos的免疫阳性细胞变化情况。用免疫荧光双标染色来定位表达CXCL1、CXCR2、pERK、c-Fos的细胞类型。5.用western blot方法检测CXCR2蛋白含量变化情况。6.用原位杂交和免疫荧光双重染色检测表达CXCL1mRNA的细胞类型。7.体外培养小鼠的星形胶质细胞结合TNF-α刺激模拟神经炎症反应，并分别用JNK抑制剂SP600125、MEK抑制剂U0126和p38抑制剂SB203580进行药物干预实验，检测MAPK对TNF-α诱导CXCL1表达的影响。8.鞘内注射CXCL1中和性抗体或CXCR2拮抗剂SB225002观察对SNL所诱导的机械性和热痛觉过敏的影响。结果：1. SNL对小鼠生长发育以及运动协调能力没有影响，但能诱导同侧后爪产生神经病理性疼痛，机械性触诱发痛和热痛觉过敏在SNL1d时就形成，并能持续21d以上。2. Real-time PCR结果显示SNL3d时脊髓内CXCL1mRNA的表达明显较正常组增加（P<0.05）。3. SNL诱导同侧L5脊髓节段背角中CXCL1免疫阳性细胞数增多，3d时就较正常组明显增加（P<0.05），10d时最显著，21d时仍较正常组增多（P<0.05）。ELISA法检测结果表明，正常小鼠L5脊髓节段中CXCL1蛋白含量较低约为7pg/ml，SNL后L5脊髓节段中CXCL1蛋白含量明显增加，SNL3d时约为11pg/ml，SNL10d时约为15pg/ml。4.免疫荧光双标染色表明CXCL1与星形胶质细胞的标记物GFAP共存，而与神经元的标记物NeuN或小胶质细胞的标记物OX-42不共存，原位杂交结果也表明CXCL1mRNA分布于星形胶质细胞中。5. GFAP和IBA1免疫荧光染色显示SNL能激活L5脊髓节段中星形胶质细胞和小胶质细胞，相关性统计分析表明SNL后CXCL1的表达和星形胶质细胞的激活具有相关性。6. SNL后TNF-α mRNA表达的增加先于CXCL1mRNA表达的增加，SNL1d时TNF-α mRNA表达增加了约8.8倍，而CXCL1mRNA在SNL3d表达才增加。可溶性的TNF受体（Etanercept）静脉注射能缓解神经病理性疼痛，并能降低CXCL1的表达。提示SNL后早期表达增加的TNF-α可能是CXCL1表达增高的诱发因子。7. TNF-α （20ng）鞘内注射后1h和3h，ELISA法检测结果表明脊髓中CXCL1蛋白含量较正常小鼠明显增加（P<0.05）。免疫荧光染色结果也表明TNF-α （20ng）鞘内注射后3h时，脊髓背角中CXCL1免疫染色强度较PBS鞘内注射组明显增强（P<0.01）。免疫荧光双标染色结果显示TNF-α鞘内注射诱导脊髓中星形胶质细胞表达CXCL1。8. TNF-α （10ng/ml）诱导体外培养的星形胶质细胞上调表达CXCL1。JNK抑制剂SP600125（10,20,50μM）能有效抑制TNF-α诱导的CXCL1表达，而MEK抑制剂U0126（20μM）和p38MAPK抑制剂SB203580（10,20,50μM）并不能抑制TNF-α诱导的CXCL1表达。9.鞘内注射CXCL1中和性抗体（1μg、4μg）能提高SNL10d时的缩爪阈值，和延长SNL10d时的缩爪潜伏期，并呈剂量依赖性。10.在正常小鼠脊髓内给予CXCL1蛋白多肽（10ng、100ng）能诱发小鼠产生热痛觉过敏，并呈剂量依赖性。正常小鼠鞘内注射CXCL1蛋白多肽（100ng）能使脊髓背角浅层（Ⅰ-Ⅱ） pERK免疫阳性神经元数量增多，但不影响脊髓背角深层（Ⅲ-Ⅴ）神经元中的ERK。同时也引起脊髓背角浅层（Ⅰ-Ⅱ）和深层（Ⅲ-Ⅴ）细胞中c-Fos免疫阳性神经元数量增多。免疫荧光双标显示CXCL1的主要受体CXCR2表达于脊髓背角神经元。11. SNL3d后脊髓背角中CXCR2免疫阳性神经元数较正常组和手术对照组增多，染色增强。Western blot结果显示SNL3d后CXCR2蛋白含量与正常组相比增加了3.4倍（P<0.05）。鞘内注射CXCR2的拮抗剂（SB225002）能提高SNL3d时的缩爪阈值，并能维持1h以上（P<0.05，与相应的溶剂组相比）；同时能延长SNL3d时的缩爪潜伏期，并能维持3h以上（P<0.05，与相应的溶剂组相比）。结论：1. SNL能诱发小鼠产生神经病理性疼痛，是可靠的神经病理性疼痛模型。2. SNL诱导脊髓CXCL1mRNA和蛋白表达增加；CXCL1主要表达于星形胶质细胞。3. SNL诱导脊髓上调表达TNF-α，并通过JNK信号通路诱导星形胶质细胞内CXCL1的表达。4.外源性给予CXCL1能诱导热痛觉过敏，并使脊髓背角神经元内pERK和c-Fos表达上调。5. SNL诱导脊髓CXCL1的主要受体CXCR2表达增加；CXCR2主要表达于神经元。6.抑制脊髓水平CXCL1或CXCR2的作用能够缓解神经病理性疼痛。7.在神经病理性疼痛状态下， CXCL1与CXCR2通过星形胶质细胞与神经元之间的相互作用参与神经病理性疼痛的维持与中枢敏化。