研究背景：随着人们生活水平的提高及生活方式的改变,2型糖尿病的发病率在我国呈现出高速发展的趋势。据2009年最新数据显示,我国2型糖尿病的发病率已达到9.7%,总患病人数9240万,跃居世界第一位。糖尿病所引起各种急慢性并发症,导致多系统组织器官功能障碍,严重影响人类的生活质量和寿命,已成为严重威胁人类健康的世界性公共卫生问题。肠促胰素(incretins)这一概念最早由La Barre于1932年提出,是指肠道衍生物具有食物依赖性促胰岛素分泌作用的肽类激素。胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(glucose-dependent insulinotropic polypeptide,GIP)是人体最重要的2种肠促胰素。GLP-1是肠道L细胞分泌的一种重要的肠肽激素,可葡萄糖依赖性的促进胰岛素合成分泌,促进β细胞增殖、抑制p细胞凋亡等作用。目前已经证实,GLP-1除了葡萄糖依赖性的促进胰岛素的分泌外,还具有抗炎活性、抗氧化应激及改善内皮细胞功能等多种优势,肠促胰素的发现使2型糖尿病在发病机制和治疗上取得了突破性的进展。然而,在2型糖尿病患者中肠促胰素效应却是明显受损或缺失的,这究竟是糖尿病所导致的一种后果,还是其本身就是糖尿病发生的一个重要机制,目前尚未有研究证实。早期研究就发现2型糖尿病患者口服葡萄糖后,肠促胰素刺激胰岛素分泌的作用较健康对照者减弱,主要表现为GIP的作用缺陷以及GLP-1的分泌减少。随后研究发现在肥胖的2型糖尿病患者肠促胰素效应的受损普遍比较瘦的患者严重,可能包括肠促激素的分泌不足、效应以及代谢异常等因素。有研究者比较了2型糖尿病患者中GIP及GLP-1受损的特点,发现GIP分泌受损较轻,而GLP-1的分泌功能受损却很严重,无论是总的或者是有活性的GLP-1的水平都远远低于正常对照人群。GLP-1分泌减少是2型糖尿病患者肠促胰素效应受损的主要特点,而肠道L细胞的早期损伤或凋亡可能是GLP-1分泌减少的主要原因并参与了2型糖尿病的发生和发展。然而,目前的研究主要关注不同药物在肠道内源性GLP-1分泌的调节作用,鲜有针对肠道L细胞的功能状态的研究。随着基因组学、蛋白质组学以及细菌培养等技术的发展,越来越多的研究表明肠道菌群对宿主代谢以及免疫功能,甚至代谢病如肥胖、糖尿病的发生发展都有着重要的作用。研究发现2型糖尿病患者肠道内的微生物菌群的构成明显改变。其硬壁菌门数量明显降低,而拟杆菌门的数量显著增加。脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)作为革兰阴性杆菌如拟杆菌门的细胞壁的主要成分,经过细菌不断的繁殖与分解,在肠道内持续的产生,机体从肠道中吸收更多的LPS,使体内血清LPS水平增高,同时肠腔内持续升高的LPS浓度势必亦对位于远端肠道散在分布的内分泌L细胞的功能产生损害。编码GLP-1的基因被称为胰高血糖素原基因(gcg),是上世纪80年代才从啮齿类动物和人类中分离得到。研究发现位于gcg基因启动子区域的启动子G1以及四个增强子G2-G5对gcg转录具有重要调控作用。经典的Wnt信号通路中起关键作用的效应因子是转录因子β-catenin,其活性为β-catenin与TCF转录因子(TCF-1,LEF-1,TCF-3和TCF7L2)结合的二聚体形式,在肠道上皮细胞中,β-catenin主要与TCF7L2结合。在非刺激状态下,细胞内游离的β-catenin的浓度由蛋白酶体介导的降解体系严密调控。在Wnt刺激下,细胞内β-catenin聚集,致使β-catenin/TCF二聚体形成从而激活其下游靶基因。近年来,研究证实肠道L细胞gcg基因的表达可由Wnt信号通路调控。二聚体β-catenin/TCF与gcg基因增强子G2内部分序列结合从而调控gcg基因转录。LPS一旦与其受体结合通过激活NADPH氧化酶途径,使细胞内活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)产生增加。细胞内ROS水平少量升高,都可刺激FOXOs转录因子蛋白家族,使其转录活性增加。2005年,Essers et al.发现了FOXO蛋白也可与β-catenin结合,这种结合方式具有高度的进化保守性,并且在氧化应激存在的情况下,它们的结合大大增加。在结肠癌细胞、骨间充质干细胞中已经得到证实FOXO蛋白与β-catenin相互作用可以明显抑制β-catenin/TCF调控的基因表达。本研究旨在探讨LPS是否通过刺激ROS产生增加FOXO与β-catenin结合,从而抑制在L细胞中β-catenin/TCF调控的gcg基因表达。因此,本课题以肠道内分泌L细胞株GLUTag细胞为研究对象,拟从以下几个方面进行初步探讨：1、观察LPS对GLUTag细胞ROS生成以及对gcg mRNA表达的影响,探讨其可能的作用机制。2、探讨LPS是否通过FOXO4基因而影响gcg mRNA的表达,并观察此影响是否通过Wrnt信号通路起作用。为进一步阐明2型糖尿病体内GLP-1分泌减少的分子机制以及探索新的糖尿病治疗靶点提供新的实验依据。第一部分脂多糖对GLUTag细胞gcg mRNA表达的影响目的：探讨脂多糖对GLUTag细胞gcg mRNA表达及其可能的作用机制。方法：(1)GLUTag细胞的培养：以含10%胎牛血清的DMEM(低糖)完全培养基在37℃,5%CO2培养箱中培养细胞。2天换液一次。(2)不同浓度LPS对GLUTag细胞ROS水平的影响：用6孔板铺板GLUTag细胞,用无血清DMEM(低糖)培养基预处理,37℃、5%CO2中培养6h,使其处于同步化状态。实验分为4组：空白对照组(简称Ctrl组),即细胞用不含脂多糖的DMEM培养基培养；含10ng/ml脂多糖组(简称10ng/ml组),细胞培养于含有终浓度为10ng/ml脂多糖的DMEM培养基；含100ng/ml脂多糖组(简称100ng/ml组),细胞培养于含有终浓度为100ng/ml脂多糖的DMEM培养基；含500ng/ml脂多糖组(简称500ng/ml组),细胞培养于含有终浓度为500ng/ml脂多糖的DMEM培养基。各组细胞在37℃、5%CO2条件下培养24h后,收集细胞用DHE探针标记,分别用细胞免疫荧光法以及流式细胞仪检测细胞内ROS水平。(3)不同浓度LPS对GLUTag细胞gcg mRNA表达的影响：分组及培养条件同上,用荧光定量PCR检测细胞内gcg mRNA的表达。(4)apocynin对GLUTag细胞ROS水平以及gcg mRNA表达的影响：细胞于6孔板中铺板,用无血清DMEM(低糖)培养基预处理,37℃、5%CO2中培养6h,使其处于同步化状态。实验分为4组：空白对照组；Apo组：600μM apocynin处理细胞1h；100ng/ml LPS组;Apo+LPS组：细胞用600p.M apocynin处理1h再用100ng/ml LPS处理24h,各组按实验要求收集细胞,用流式细胞仪检测细胞内ROS水平,用荧光定量PCR检测细胞内gcg mRNA的表达。结果：(1)不同浓度LPS对GLUTag细胞内ROS生成的影响：荧光显微镜下观察发现,空白对照组与10ng/ml LPS组中红色荧光强度微弱,而100ng/ml LPS组荧光强度明显增强,用500ng/ml LPS处理细胞后红色荧光强度在四组中最强。流式细胞仪结果显示,正常对照组荧光强度较低(31.00±4.65),100ng/ml组和500ng/ml组细胞内ROS水平明显增高,分别高达52.17±4.09和67.13±4.46(P<0.001和P<0.001),lOng/ml组ROS水平轻度升高为32.47±2.77,与正常对照组相比无显著性差异(P=0.670)。四组间差异有统计学意义(F=54.127,P<0.001)。(2)不同浓度LPS对GLUTag细胞gcg mRNA表达的影响：空白对照组的2-△△ct值为0.99±0.11,10ng/ml LPS组为0.98±±0.11,两组间无显著性差异(P=0.828)。100ng/mlLPS组和500ng/ml LPS组的的2-△△Ct值分别为0.49±±0.07和0.244±0.03,与对照组相比明显降低,四组间差异有统计学意义(F=113.354,P<0.001)。(3)apocynin对LPS作用GLUTag细胞后细胞内ROS水平以及gcg mRNA表达的影响：加入apocymin预处理组与不加抑制剂的LPS组相比,细胞内ROS水平由52.17±4.09下降至37.7±5.76,有统计学差异(P=-0.024)。同时,gcg mRNA表达水平从0.49±0.07上升到0.88±0.06,差异有统计学意义(P<0.001)。结论：随着LPS浓度的升高,可以使GLUTag细胞内ROS水平上升,而gcg mRNA表达相应的下降,并且NADPH氧化酶抑制剂apocynin可以阻抑这一作用。提示LPS刺激引起的ROS可能与内分泌L细胞gcg mRNA表达下降有关。第二部分脂多糖抑制GLUTag细胞gcg mRNA表达的分子机制探讨目的：探讨转录因子FOXO4对GLUTag细胞gcg mRNA表达的影响,进而了解脂多糖抑制GLUTag细胞gcg mRNA表达的可能分子机制。方法：(1)FOXO4基因对GLUTag细胞gcg mRNA表达的影响：用24孔板铺板GLUTag细胞,用无血清DMEM (低糖)培养基预处理,37℃、5%CO2中培养6h,使其处于同步化状态。实验分为4组：空白对照组(简称Ctrl组),细胞用不含脂多糖的DMEM培养基培养24h；含100ng/ml脂多糖组(简称LPS组),细胞用含有终浓度为100ng/ml脂多糖的DMEM培养基培养24h；转染shFOXO4过表达质粒组(简称shFOXO4组),细胞转染shFOXO4过表达质粒24h后,用不含脂多糖的DMEM培养基再培养24h；转染siRNA-FOXO4小干扰RNA组(简称si-FOXO4组),细胞转染siRNA-FOXO4小干扰RNA片段24h后,用含有终浓度为100ng/ml脂多糖的DMEM培养基再培养24h。收集细胞用荧光定量PCR检测gcg mRNA表达。(2)不同浓度LPS对二聚体β-catenin/TCF转录因子活性的影响：用24孔板铺板GLUTag细胞,用无血清DMEM(低糖)培养基预处理,37℃、5%CO2中培养6h,使其处于同步化状态。实验分为4组：空白对照组(简称Ctrl组),含100ng/ml脂多糖组(简称LPS组),50ng/ml重组蛋白Wnt3a组(简称Wnt3a组),含50ng/ml重组蛋白Wnt3a+100ng/ml脂多糖组(简称100ng/ml组)。用双荧光素酶报告检测β-catenin/TCF转录因子活性。(3) FOX04对二聚体β-catenin/TCF转录因子活性的影响：GLUTag细胞用24孔板铺板,用无血清DMEM(低糖)培养基预处理,37℃、5%CO2中培养6h,使其处于同步化状态。在转入pTOPFLASH荧光素酶报告基因的同时,共同转入shFOXO4过表达质粒或小干扰RNAsi-FOX04。实验分为4小组：空白对照组(简称Ctrl组),含100ng/ml脂多糖组(简称LPS组),转染shFOXO4过表达质粒组(简称shFOXO4组),转染siRNA-FOXO4小干扰RNA组(简称si-FOXO4组)。四组分别在重组蛋白Wnt3a存在或不存在的情况下用双荧光素酶报告检测β-catenin/TCF转录因子活性。(4) LPS对GLUTag细胞FOXO4/β-catenin以及TCF7L2/β-catenin二聚体形成的影响：实验分为4组：空白对照组(简称Ctrl组),50ng/ml重组蛋白Wnt3a组(简称Wnt3a组),含100ng/ml脂多糖组(简称LPS组),含50ng/ml重组蛋白Wnt3a+100ng/ml脂多糖组(简称Wnt3a+LPS组)。用蛋白质免疫共沉淀技术分别检测anti-FOXO4和anti-TCF7L2抗体沉淀下来的蛋白中β-catenin的表达水平,计算蛋白相对灰度值。结果：(1) FOXO4基因对GLUTag细胞gcg mRNA表达的影响：与正常对照组(0.99±0.11)相比,LPS作用细胞后gcg mRNA表达为0.49±0.07(P<0.001),而GLUTag细胞转染shFOXO4过表达质粒后,其gcg mRNA表达也下降至0.41±0.05(P<0.001)。而si-FOXO4组比LPS组gcg mRNA表达上升至0.80±0.08(P<0.001)。四组间差异有统计学意义(F=72.180,P<0.001)。(2)LPS对二聚体β-catenin/TCF转录因子活性的影响：荧光光度计检测各组间相对荧光素酶单位(RLU)值用析因方差分析,LPS与重组蛋白Wnt3a两种干预之间有交互作用(F=81.389,P<0.001)。LPS组RLU值(0.17±0.01)明显低于Ctrl组(0.26±0.01)(P<0.001)。而用Wnt3a处理细胞24h,接着用100ng/mlLPS处理后,RLU值与Wnt3a处理组相比(0.74±0.01)上升至0.47±0.03(P<0.001)。(3) FOXO4对二聚体β-catenin/TCF转录因子活性的影响：各组RLU值之间有显著差异(F=47.950,P<0.001)。与对照组相比(0.26±0.01),shFOXO4组与LPS组都使RLU值下降,分别达0.13±0.02和0.17±0.01(P<0.001和P<0.001)。而siFOXO4组与LPS组相比RLU值从0.17±0.01升高至0.23±0.2(P=0.001)。在重组蛋白Wnt3a存在的条件下,各组间RLU值有显著差异(F=145.072,P<0.001)。shFOXO4组和LPS组分别使RLU值从0.74±0.01下降至0.38±0.03和0.47±0.03,差异有统计学意义(P<0.001和P<0.001)。转入si-FOXO4干扰后,LPS组的RLU值上升达到0.57±0.02(P<0.001)。(4)LPS对GLUTag细胞FOXO4/β-catenin以及TCF7L2/β-catenin二聚体形成的影响：免疫共沉淀方法检测anti-FOX04抗体沉淀下来的蛋白中β-catenin表达水平用析因方差分析,LPS与重组蛋白Wnt3a两种干预之间有交互作用(F=47.365,P<0.001)。与正常组相比(1.00±±0.04),LPS组与转录因子FOXO4结合的β-catenin增多至1.68±0.07(P<0.001)。Wnt3a+LPS组与Wnt3a组相比,与FOXO4结合的β-catenin从1.30±0.06增加至2.43±0.05,差异有统计学意义(P<0.001)。免疫共沉淀方法检测anti-TCF7L2抗体沉淀下来的蛋白中β-catenin表达水平用析因方差分析,LPS与重组蛋白Wnt3a两种干预之间无交互作用(F=0.062,P=0.809)。与正常组相比(1.00±0.03),LPS组与转录因子TCF7L2结合的β-catenin减少至0.62±0.08(P=0.002)。Wnt3a+LPS组与Wnt3a组相比,与TCF7L2结合的β-catenin从1.77±0.11减少至1.37±0.1,差异有统计学意义(P=0.009)。结论：LPS可能是通过FOXO4干预了二聚体β-catenin/TCF活性,其机制可能是通过FOXO4和TCF7L2竞争与β-catenin蛋白结合,从而抑制Wnt信号通路活性,最终抑制gcg mRNA的表达。