论文部分内容阅读
Toll样受体家族(Toll-like receptor family)是一类典型的模式识别受体(pattem recognition receptor,PRR),能够识别病原相关分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP)并激活下游相关信号通路,启动固有免疫应答。Toll受体3(Toll-like receptor 3,TLR3)是TLR家族中的重要成员,在抗病毒固有免疫应答中发挥重要作用。TLR3识别病毒感染产生的双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)结构后,通过Myd88非依赖性途径,激活IRF3和NF-κB,诱导Ⅰ型干扰素和促炎性细胞因子的生成,抑制病毒的复制,限制感染的进一步扩散。研究表明,TLR3信号通路在抗疱疹病毒感染以及抗肿瘤免疫中起着不可替代的作用。马立克氏病病毒(Marek’s disease virus,MDV)是一种α亚科疱疹病毒,可引起以T细胞淋巴瘤和免疫抑制为主要临床特征的鸡马立克氏病(Marek’s disease,MD),给养禽业造成巨大的经济损失。MDV致病毒株感染鸡通常要历经四个阶段,即早期溶细胞感染阶段、潜伏期阶段、晚期溶细胞感染阶段和转化阶段。转录组学数据显示,在MDV感染的4个不同阶段中,脾脏、法氏囊、胸腺等免疫器官中TLR3信号通路相关分子的转录水平都出现了显著性变化。尤其是在晚期溶细胞感染和肿瘤转化阶段,TLR3信号通路相关分子的表达受到了明显的抑制,暗示该信号通路是宿主抗MDV免疫反应的一个重要组成部分。近期的研究结果表明,激活TLR3应答不仅能在体外有效抑制MDV的复制,同时也能够明显抑制体内MD肿瘤的发生和发展。但是TLR3信号通路如何抑制MDV感染和肿瘤生成,目前尚不清楚。本研究主要通过转录组学、免疫学和分子生物学等研究方法,探索了激活TLR3信号通路对MDV感染的鸡胚成纤维细胞以及MDV转化的鸡T细胞淋巴瘤细胞系的影响及其分子机制,为解释TLR3在宿主抗MDV免疫应答中作用提供了重要线索和数据。1.Poly(I:C)抑制MDV感染的机制本研究通过在MDV感染CEF后不同时间点激活TLR3信号通路,探究TLR3应答对MDV不同复制阶段的抑制效果。研究结果表明,MDV感染后的任意时间点激活TLR3均能有效降低MDV的病毒滴度和gB基因的转录水平。Real-time PCR检测显示poly(I:C)处理后,MDV感染细胞中TLR3信号通路相关分子的表达水平显著提高,其中TLR3、IRF3和IKKα的上调表达水平最为显著。同时IFN-β、IL-6和TNF-α等下游效应分子也出现相应的上调表达。我们又使用小分子抑制剂BX795和Resveratrol分别抑制TLR3介导的IRF3和NF-κB活化,探究Ⅰ型干扰素和促炎性细胞因子对MDV感染的影响。结果显示,10μM BX795和100μM Resveratrol可分别有效抑制TLR3介导的Ⅰ型干扰素和促炎性细胞因子合成,且不显著影响细胞活性。对于已感染MDV的CEF,无论是10μMBX795还是100μM Resveratrol都只能削弱但不能完全废除TLR3激活对MDV感染的抑制效果。这表明TLR3信号通路诱导产生的Ⅰ型干扰素和促炎性细胞因子均能在体外有效抑制MDV的感染。2.Poly(I:C)特异性诱导MD肿瘤细胞系MSB1凋亡若干研究表明,dsRNA不仅能激活固有免疫,同时也可通过不同的作用机制诱导肿瘤细胞凋亡。MSB1细胞系是一种由MD肿瘤衍生而来的鸡T淋巴瘤细胞系,但dsRNA能否诱导MSB1细胞凋亡还未见报道。本研究使用合成的dsRNA类似物poly(I:C)刺激MSB1细胞,通过形态学、分子生物学、细胞生物学、免疫学等多种方法检测细胞是否发生凋亡。结果显示,poly(I:C)刺激能够导致MSB1细胞的死亡而不引起包括DF-1、CEF、CEK、HD11以及DT40等在内的其他禽源传代细胞系或原代细胞死亡,同时MSB1细胞的死亡数量与poly(I:C)终浓度和刺激时间呈显著正相关。poly(I:C)刺激后的MSB1细胞出现崩解,折光性下降,与凋亡细胞的形态学变化相似。随后的流式细胞术分析显示,poly(I:C)刺激组MSB1细胞的Annexin V阳性细胞比例明显高于对照组细胞,证明poly(I:C)刺激引起了 MSB1细胞的凋亡。与此同时,poly(I:C)刺激后,MSB1细胞中Caspase3/7、8、9活性较对照组都有极显著的上调,进一步确认了细胞凋亡的发生。JC-1染色结果证实MSB1细胞经poly(I:C)处理后出现线粒体膜电位丢失,与Caspase 9活性增强的结果相一致,暗示内源性细胞凋亡途径的激活。基因组DNA电泳分析结果显示,poly(I:C)刺激后的MSB1细胞基因组出现凋亡特征性DNA ladder,验证了 Caspase 3的激活和凋亡的发生。而泛Caspase抑制剂Z-VAD-FMK可完全抑制poly(I:C)诱导的MSB1细胞凋亡。综上所述,本研究结果证实TLR3配体poly(I:C)可通过Caspase依赖性途径特异性诱导MD肿瘤细胞系MSB1的凋亡,这一结果暗示poly(I:C)可用于MD的防治和淋巴瘤的治疗。3.Poly(I:C)诱导MSB1细胞凋亡的机制TLR3信号通路已被证实可以通过多种方式诱导肿瘤细胞的凋亡。前期研究结果显示TLR3配体poly(I:C)能够特异性诱导MD肿瘤细胞系MSB1凋亡。本研究通过小分子抑制剂、流式细胞术、荧光素酶报告系统、real-time PCR等技术手段,探究TLR3信号通路在poly(I:C)诱导MSB1细胞凋亡中的作用。首先,real-time PCR检测结果显示,poly(I:C)诱导MSB1细胞凋亡的过程中,接头分子TLR3、TRIF、TRAF6、RIP1、TANK、IKKα以及促凋亡分子Bak、p53、Fas等均出现显著上调表达,IFN-β和TNF-α也出现对应的显著上调表达,证明TLR3信号通路与poly(I:C)诱导MSB1细胞凋亡有密切关系。随后,我们使用小分子抑制剂Pepinh-TRIF、BX795和Resveratrol对TLR3信号通路的不同接头分子进行阻断,探究TLR3信号通路在poly(I:C)诱导MSB1细胞凋亡中的具体作用机制。经过摸索,50μM Pepinh-TRIF、10μM BX795 和 50μM Resveratrol 可分别有效阻断 MSB1 细胞中接头分子TRIF、IRF3和NF-κB的活化,且对MSB1细胞活性没有明显影响。接着我们将MSB1细胞用上述抑制剂进行处理,然后再用poly(I:C)加以刺激。结果显示,50μM Pepinh-TRIF和50μM Resveratrol均可显著抑制poly(I:C)刺激引起的细胞死亡,且Annexin V阳性细胞比例和Caspase活性也都出现显著下降;而10μM BX795对poly(I:C)诱导的MSB1细胞凋亡没有任何抑制作用。综上所述,TLR3信号通路中的接头分子的TRIF和NF-κB对poly(I:C)诱导MSB1细胞凋亡是不可或缺的。本研究结果初步阐明了 poly(I:C)通过TLR3信号通路触发MSB1细胞凋亡的分子机制,进一步明确了 TLR3在抗MDV和抗肿瘤应答中的作用,为开发新型MDV疫苗以及抗肿瘤药物提供了一定的理论参考。