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纤维二糖转运蛋白CDT-1和CDT-2在纤维素酶的诱导表达信号通路中起着关键的作用,同时在用于生物质转化的酵母工程菌改造方面有非常重要的应用价值。但是目前对纤维二糖以及其它糖转运蛋白的寡聚体或复合体的结构与功能知之甚少,纤维二糖转运蛋白CDT-1和CDT-2在纤维素酶诱导表达过程中的作用机制也不清楚。分离纯化CDT-1和CDT-2寡聚体或复合体,鉴定其组成、结构以及蛋白质修饰方式和互作蛋白,是解析CDT-1和CDT-2蛋白质结构与功能的关系、了解CDT-1和CDT-2传递信号的机理和定向改造纤维二糖转运蛋白、提高转运活性的一个重要环节。本试验旨在建立粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)中利用串联亲和纯化标签GFP::BCCD分离纯化膜蛋白的方法,并探索出分离纯化膜蛋白CDT-1和CDT-2所需的溶解与交联条件。本试验以CDT-1和CDT-2为研究对象,分别构建了cdt-1和cdt-2与绿色荧光蛋白(gfp)-生物素结合标签(bccd)融合表达菌株cdt-1::gfp::bccd和cdt-2::gfp::bccd。我们发现,微晶纤维素(Avicel)可以诱导N.crassa表达CDT-1::GFP::BCCD和CDT-2::GFP::BCCD,融合表达蛋白中的生物素结合标签BCCD能够有效结合生物素。适用于溶解膜蛋白CDT-1::GFP::BCCD的去污剂有Triton X-100、CHAPS、Tween-20和digitonin;在这些不同的去污剂溶解条件下,CDT-1::GFP::BCCD在BN-PAGE中的迁移率有所差别;对于Tween-20和digitonin,当使用的去污剂/蛋白质比例不同时,CDT-1::GFP::BCCD的迁移率也不一样,表明细胞中存在不同状态的CDT-1::GFP::BCCD。化学交联剂crosslinker A可以有效交联CDT-2::GFP::BCCD蛋白质多聚体/复合体;经过crosslinker A交联后,再用温和的去污剂溶解,可得到比较稳定的CDT-2::GFP::BCCD蛋白质多聚体/复合体;Avicel或sucrose处理的蛋白质样品,CDT-2::GFP::BCCD在BN-PAGE中呈现出不同的迁移率,这表明了Avicel或sucrose处理后,CDT-2::GFP::BCCD的蛋白质状态是不同的。利用Dynabeads M280~?Streptavidin进行pulldown,可有效分离出溶解后的CDT-1::GFP::BCCD和CDT-2::GFP::BCCD。本试验探索出了纤维二糖转运蛋白CDT-1和CDT-2交联与溶解的适宜条件,成功建立了利用Dynabeads M280~?Streptavidin纯化N.crassa中带有GFP::BCCD标签的膜蛋白CDT-1和CDT-2的方法。为分离纤维二糖转运蛋白质及其寡聚体/复合体、鉴定蛋白质的修饰方式及互作蛋白,分析CDT-1和CDT-2的结构与功能的关系奠定了基础。本试验将为研究糖转运蛋白的结构与功能的关系提供借鉴,也为今后开发利用糖转运蛋白、提高它们的经济效益提供理论依据。