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乙酰甲喹(Mequindox，MEQ)，化学名为3-甲基-2-乙酰基-喹噁啉-N1，N4-二氧化物，是喹噁啉类兽药的衍生物，具有高效的抗菌和促进生长的功效，在畜牧业中被广泛地用于动物相关疾病的预防和治疗。然而，如果使用不适当，往往容易引起动物中毒，影响畜禽产品和食品的安全性。在本实验室的前期研究中，发现MEQ可通过诱导活性氧的产生，从而引起细胞的DNA损伤和细胞周期阻滞。研究表明，MEQ在动物体内的代谢主要有三种途径：氮氧还原、羰基还原和羟化反应。本实验的前期研究已鉴定到参与MEQ羟化的酶--猪CYP3A22，其在原代猪肝细胞中过表达，可逆转MEQ引起的细胞周期阻滞现象。为了进一步深入研究和完善MEQ的代谢机制，本论文以畜禽的代表猪和鸡作为研究对象，从MEQ羰基还原的角度，分离和鉴定了参与MEQ羰基还原代谢的酶，并初步探讨其作用机制，主要取得了以下研究结果。 1.乙酰甲喹和羰基还原乙酰甲喹的毒性比较为了明确MEQ的关键基团之一--羰基的毒性效应，我们采用MTT实验比较了MEQ和其羰基还原产物2-(2-羟基)乙基乙酰甲喹(CR-MEQ)对人肝癌细胞HepG2的毒性。结果显示，MEQ的半致死剂量(IC50)是58.71μg/ml，而羰基还原产物CR-MEQ的IC50是260.44μg/ml，比MEQ高约5倍。这说明MEQ的羰基是其主要的毒性基团之一，它的还原对MEQ的解毒起到重要作用。 2.鸡和猪体内参与催化乙酰甲喹羰基还原代谢关键酶的筛选肝脏是动物进行外源化合物代谢的主要产所。因此，首先分析了鸡和猪的肝脏是否参与了MEQ的羰基还原代谢。鸡或猪的肝脏胞浆与MEQ孵育后，采用HPLC检测其代谢产物。结果显示：在不加任何辅助因子时，鸡或猪胞浆只表现出弱的羰基还原代谢能力(2.927±0.438 pmol/min·mg for chicken and4.055±0.680 pmol/min·mg forpig)；当在孵育体系中加入辅酶NADPH时，肝脏胞浆表现出较高的羰基还原活性(36.581±5.162 nmol/min·mg for chicken and22.539±8.545 nmol/min·mg for pig)。进一步，在孵育体系中加入CBR1的特异抑制剂--槲皮素(Quercetin，QUE)时，鸡或猪肝脏胞浆对MEQ的羰基还原代谢能力明显减弱(3.915±2.193 nmol/min·mg forchicken and4.495±1.730 nmol/min·mg for pig)。以上结果提示，鸡和猪的肝脏参与了MEQ的羰基还原代谢，且肝脏胞浆中的CBR1很可能是参与MEQ羰基还原代谢的关键酶。 3.体外重组表达鸡和猪CBR1s的活性鉴定和比较为了进一步确定鸡和猪CBR1参与MZQ羰基还原代谢的功能，以不同浓度的MEQ或N1-脱氧乙酰甲喹(N1-desoxymequindox，N1-DO-MEQ)作为底物研究了CBR1s的酶动力学特征(Michaelis-Menten kinetic analysis)。结果显示：cCBR1催化MEQ的Vmax为1.21±0.03 nmol/min·mg protein，Km为156.00±12.47μM；pCBR1催化MEQ的Vmax为0.49±0.03 nmol/min·mg protein，Km为469.80±54.76μM。cCBR1催化N1-DO-MEQ的Vmax为5.27±0.32 nmol/min·mg protein，Km为105.00±22.43μM；pCBR1催化N1-DO-MEQ的Vmax为5.26±0.25 nmol/min·mg protein，Km为116.10±19.27μM。以上结果说明，cCBR1比pCBR1催化MEQ羰基还原代谢的活力高，且MEQ在发生N1脱氧反应以后，更容易被CBR1催化。 4.鸡和猪CBR1参与MEQ羰基还原代谢的活性差异的机制分析已有研究表明，影响CBR1的活性的关键位点主要有催化活性中心的Asn-Ser-Tyr-Lys和底物口袋中的Met和Trp。序列对比分析发现：鸡和猪CBR1的活性中心关键氨基酸相同，底物口袋处在229/230位的Trp也相同，而141/142位氨基酸有明显的性质差异。因此，我们采用点突变技术，分别针对141/142的氨基酸设计突变体并分析了突变体的活性。结果显示：当cCBR1第141位的Val突变成pCBR1的Glu之后，催化速率从1018.67±26.63μM/min·mg protein减小至825.33±10.07**μM/min·mg protein；而当pCBR1第142位Glu突变成cCBR1的Val之后，速率从8.50±0.24μM/min·mg protein增大至11.00±0.94*μM/min·mg protein。以上结果表明，cCBR与pCBR1活性差异的主要原因之一可能是141/142位氨基酸的侧链极性和带电性的不同，从而导致了CBR1s与MEQ结合稳定性不同，进而引起的活性差异。 综上所述，本研究以禽畜代表鸡和猪作为研究对象，筛选和鉴定了鸡和猪体内参与MEQ羰基还原代谢的关键酶CBR1，并进一步分析了鸡和猪CBR1活性存在物种差异的机理。本研究的结果丰富了对MEQ代谢机制的认识，可为其他喹嗯啉类药物在动物体内代谢途径的研究以及MEQ的合理使用和安全控制提供了理论参考。