论文部分内容阅读
哺乳动物的Corti器由感觉细胞(内、外毛细胞)和支持细胞(Hensen细胞、Deiter细胞和柱细胞等)组成。Hensen细胞对Corti器及毛细胞的微环境平衡的维持有着非常重要的作用。在耳蜗中，ATP的生理性来源是非常广泛的。在对Hensen细胞给予10uMATP可以引起一种快速的内向性离子流并伴随有细胞内游离钙的增加，但不同浓度ATP对Hensen细胞的电生理特性影响和细胞内游离钙升高的来源仍需要做进一步系统研究。噪声性聋与钙离子的关系密切。nifedipine对噪声性听力损失有一定的改善作用。长期以来，一直认为钙通道阻滞剂包括nifedipine是通过改善耳蜗微循环和对L型钙通道进行阻断从而起到改善噪声性听力损失的作用。本文的实验内容是研究单离Hensen细胞的离子通道及电生理特性，并观察ATP和nifedipine对其的影响。 本文的实验目的是①建立适合膜片钳技术的单离Hensen细胞的分离方法②研究豚鼠耳蜗单离Hensen细胞的钾离子电流及其特性和ATP对Hensen细胞电生理特性的影响。③研究高浓度ATP作用于豚鼠耳蜗单离Hensen细胞所引起的内向性离子流以及Nifedipine对这种离子流的抑制。 本文选用耳廓反射灵敏的健康杂色豚鼠，取豚鼠耳蜗，获得Corti器，采用酶消化和机械分离的方法对Hensen细胞进行分离，并选择胞膜清晰，胞质透明的单离细胞进行实验。采用传统全细胞膜片钳技术，对单离Hensen细胞进行记录。ATP和Nifedipine则通过压力注射仪对单离Hensen细胞给药。其结果如下： 1．适合膜片钳研究的豚鼠耳蜗单离Hensen细胞的分离技术： 每只耳蜗可以获得单离Hensen细胞12±3个。活性良好的单离Hensen细胞边界清楚，有明显的双折射现象，无水肿，胞浆半透明，呈圆形或椭圆形，大小不一致，内含有一个或数个大小不一的圆形脂滴，脂滴边界清晰，有很强的折光现象，没有发现Hensen细胞的细胞核。 2．单离Hensen细胞电压依赖性钾电流：军医进修学院硕士论文 中文摘要 钳制电压为一70my，刺激电压从一90my间隔 10my逐步去极化到 30my，在一30my以上记录到越来越大的外向电流，与延迟整流性钾电流相似，可以被细胞内的140。OVL氯化格（CSCI）所阻断，且当给予钾通道阻滞剂四乙基按 （TE）40InM时，电流的幅度明显降低。此电流无明显快速激活和失活的 I＾电流，只有I。电流。 3．低浓度ATP对Hensen细胞电压依赖性钾电流的抑制作用： 给予Hensen细胞0．IWhol／L（n＝6）、IWhol／L（n＝6）和 10Whol／L（n＝9）浓度的 ATP时，Hensen细胞的钾电流受到抑制。0．IWhol／L ATP对 Hensen细胞钾电流的抑制百分率「（正常钾电流幅度一加药后电流幅度）／正常钾电流幅度］为 3．51 土 3．8％（n＝6，P）0．05），而 IWhol／L（n＝6，P＜0．01）和10Whol／L（n＝9，P（．01川TP对Hensen细胞的抑制率分别为 12．58士4．62％和44．49上9．76此 可见呈浓度依赖性，浓度越高，抑制率越大，对钾电流抑制的50％抑制强度所需的最小药物浓度值仅C。＊值为12．88士 1．58 pM。 4．高浓度ATP所引起的内向性离子流： 当 给 予Hensen 细 胞100thed／L（n＝10）、1。of／L（n＝10） 和10mmol几h乃）ATP刺激时，Hensen细胞开始出现内向电流，并随着浓度的增加，内向电流越大，呈浓度依赖性，并可以被100hoof／LsuraminMTP受体的阻断剂）所抑制。 5．NifediPine （10Who几）对ATP所引起的内向性离子流的抑制 当同时给予Hensen细胞（n＝5＞lmmol／L ATP和 Nifedipine刺激时，内向性电流消失，开始出现外向性电流，但电流的幅度与正常相比明显降低，降低的百分比为49．02士1．81％（P＜0．05） 本文重点讨论了采用合适的胰蛋白酶浓度的选取和对培养皿进行多聚赖氨酸处理等措施所获得的Hensen细胞用Axopach1D膜片钳放大器做全细胞膜片钳记录的可行性：Hensen细胞外向性钾电流与EP电位的关系；低浓度ATP对Hensen细胞钾电流的抑制；高浓度ATP所引起内向离于流的性质；NifediPine对ATP引起的内向性离子流的抑制与改善噪声性听力损失的关系。 3军医进修学院硕士论文 中文摘要根据实验结果和讨论，本文的结论是：①通过酶消化结合机械分离的方法，能成功分离到单离Hensen细胞。通过采用合适的胰蛋白酶浓度的选取和对培养皿进行多聚赖氨酸处理等措施，所分离Hensen细胞的活性和贴壁状况在电压门控通道方面和化学门控通道方面均满足了膜片钳技术的要求；②Hensen细胞外向性钾电流参与了耳蜗中厂循环和平衡；③Hensen细胞外向性钾电流参与了EP的形成；④低浓度ATP对钾电流的抑制可能直接作用于钾通道，而且还是可逆的；⑤高浓度ATP所引起非选择性离于流的进入可能激活了胞内的三磷酸肌醇系统，引起细胞内钙库的释放，以致使细胞内游离钙达到一定的高度；③nifedipine可以通过抑制ATP非选择性离子流来阻止Hensen细胞的钙超载，改善耳蜗中的钾离于循环?