研究目的慢性胰腺炎(chronic pancreatitis, CP)是常见的胰腺疾病之一,发病率呈上升趋势。疼痛是CP治疗最棘手的难题,严重影响患者的生活质量。长期以来,由于对其发病机制缺乏深入认识,目前尚无满意的治疗手段,临床治疗仅限于对症,疗效欠佳。近年来研究认为神经源性炎症是CP持续性疼痛的重要发病机制。CP时神经及神经束膜受损,炎细胞、免疫细胞浸润,多种炎性介质、神经肽、神经营养及神经因子的释放,可致敏损伤的感觉神经,参与胰腺痛觉高敏的形成。蛋白酶激活受体2(proteinase-activated receptor 2, PAR2)属于蛋白酶激活受体超家族的一员,是慢性疼痛和神经源性炎症研究领域的关注新热点。PAR2功能性表达于初级传入神经元,可直接促进伤害性信息上传或通过致敏辣椒素(transient receptor potential vanilloid 1, TRPV1)受体,介导痛觉高敏和神经源性炎症的发生发展。PAR2在胰腺局部及支配胰腺的背根神经节中均有表达,与胰腺炎症、外分泌等功能息息相关。但PAR2在CP时的表达变化以及其在CP疼痛中所发挥的作用尚未见报道。为此,我们采用三硝基苯磺酸(trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS)逆行胰胆管注射的方法建立CP大鼠模型,观察PAR2及TRPV1受体在背根神经节中的表达变化并明确PAR2在CP热痛觉高敏感形成中的作用。非甾体类抗炎药(nonsteroidal anti-inflammatory durgs, NSAIDs)是临床常用的治疗CP疼痛的药物。但长期口服该药对CP疼痛及纤维化的影响不详。口服选择性COX-2抑制剂罗非考昔可通过抑制巨噬细胞迁移及星形细胞的激活减轻CP的炎症进展,抑制胰腺纤维化,发挥保护性作用。而NSAIDs的突出副作用为胃肠道黏膜损伤,可致菌群移位,内毒素血症的发生。且NSAIDs类药物能诱发组织氧化应激的形成。内毒素及氧化应激正是加重胰腺纤维化的关键因素。因此,为明确长期口服NSAIDs类药物在CP疼痛及纤维化进程中是发挥保护性还是伤害性作用,我们采用CP大鼠模型,观察了长期应用萘普生对模型大鼠热痛觉阈值和纤维化的影响。研究方法健康雄性SD大鼠,体重250-300g。采用胰胆管内逆行注射TNBS的方法建立CP大鼠模型。假手术组大鼠开腹翻动胰腺后即关腹。利用腹部热痛阈值观察CP大鼠的热痛觉高敏现象。取材T8-T10节段背根神经节,采用免疫荧光及Western blot方法观察背根神经节(dorsal root ganglia, DRG)中PAR2及TRPV1受体的表达变化。并将PAR2的Western blot结果与相应的腹部热痛阈值行相关分析。采用高剂量(50000u/Kg)及低剂量(25000u/Kg)胰蛋白酶抑制剂乌司他丁抑制PAR2的活性,观察急性及慢性(连续给药5天)腹腔给药后对CP大鼠腹部热痛阈的影响。萘普生的给药方法选择灌胃及腹腔注射,剂量选择为20mg/Kg及40mg/Kgo TNBS胰管内注射2周后开始给予萘普生治疗,共给药3周。取材胰腺组织,行苏木素-伊红(hematoxylin and eosin, HE)染色及病理评分来判断胰腺损伤；以Van-Gieson (VG)或Sirus-red染色后的胶原表达阳性面积和胰腺组织的羟脯氨酸含量评价胰腺的纤维化程度。ELESIA法检测血清中肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor, TNF-a)表达以明确萘普生的全身效应。通过血浆二胺氧化酶(diamine oxidase, DAO)及内毒素检测评价肠黏膜屏障的功能。选择SPSS 13.0软件行统计学分析,P<0.05被认为有统计学差异。结果1、CP热痛觉高敏感大鼠模型的建立TNBS逆行胰胆管注射4周后取材胰腺组织行HE染色,发现胰腺组织出现不同程度的胰管周围及小叶内纤维化,以胰管周围纤维化为主；片状的急、慢性炎细胞浸润；主胰管扩张及节段性腺体萎缩,但胰岛结构完整。假手术组大鼠胰腺无明显组织病理学改变。且模型大鼠胰腺的胶原含量增加,Sirus-red染色阳性面积为5.73±1.45%,高于假手术组的2.23±0.42%(P=0.001)。模型大鼠羟脯氨酸含量亦增高,为519.34±168.52ug/g,高于假手术组的328.02±59.08ug/g (P=0.003)。模型大鼠的腹部热痛阈值较假手术组相比明显降低,分别为6.52±0.68秒和10.68±1.28秒(P=0.000)。TNBS逆行胰胆管注射可成功建立CP热痛觉高敏感大鼠模型。2、PAR2在CP大鼠的背根神经节中表达上调CP大鼠背根神经节中PAR2表达上调,其相对于内参GAPDH的灰度值为1.00,0.80-1.27。高于假手术组的0.45,0.40-0.49(P=0.004)。免疫荧光结果示PAR2表达于背根神经节的中-小直径神经元。高倍镜下计数CP大鼠PAR2表达的阳性百分比,共计数1457个神经元,共有896个神经元PAR2表达阳性,阳性百分比为61.98%,54.43%-69.23%。假手术组大鼠共计数1448个神经元,共有710个神经元PAR2表达阳性,阳性百分比为49.23%,35.70%-56.20%。CP大鼠PAR2表达的阳性百分比高于假手术组(P=0.000)。CP大鼠背根神经节中PAR2的累积荧光密度亦高于假手术组(P=0.000),分别为336.31±73.00和155.47±51.42。以上结果示PAR2在CP大鼠的背根神经节中表达上调。CP大鼠背根神经节中TRPV1表达亦上调,其相对于内参GAPDH的灰度值为0.85,0.57-0.87；高于假手术组的0.38,0.36-0.55(P=0.036)。免疫荧光结果示TRPV1表达于背根神经节中的小直径神经元。高倍镜下计数CP大鼠TRPV1表达的阳性百分比,共计数1432个神经元,共有881个神经元TRPV1表达阳性,阳性百分比为61.47%,55.82%-66.81%。假手术组大鼠共计数1358个神经元,共有577个神经元TRPV1表达阳性,阳性百分比为46.11%,37.44%-51.39%。CP大鼠TRPV1表达的阳性百分比高于假手术组(P=0.000)。CP大鼠背根神经节中TRPV1的累积荧光密度亦高于假手术组(P=0.003),分别为255.58±75.52和62.89±50.99。以上结果示TRPV1在CP大鼠的背根神经节中表达亦上调。4、PAR2介导CP大鼠热痛觉高敏感的形成将每只大鼠的腹部热痛阈值与该大鼠背根神经节中PAR2的Western blot灰度值行相关分析,结果示PAR2的蛋白表达增加与降低的腹部热痛阈值呈显著的负相关(r=-0.821,P=0.001)。急性乌司他丁腹腔注射可抑制CP大鼠的腹部热痛觉高敏现象,且呈剂量依赖性：高剂量乌司他丁急性腹腔注射后CP大鼠的腹部热痛阈为8.67±1.76秒,高于对照组大鼠(6.17±1.05,P=0.001)；低剂量乌司他丁急性腹腔注射后CP大鼠的腹部热痛阈为7.74±1.00秒,亦高于对照组大鼠(6.17±1.05,P=0.013)。而连续5日乌司他丁治疗对CP大鼠的腹部热痛阈无影响(P>0.05)。5、萘普生治疗对大鼠一般情况及血清TNF-α表达的影响溶剂羧甲基纤维素治疗组CP大鼠的死亡率为20%；萘普生20mg/Kg治疗组(口服及腹腔注射)CP大鼠的死亡率为25%；萘普生40mg/Kg腹腔注射治疗组的死亡率为27.5%；而大剂量萘普生(40mg/Kg)口服治疗组CP大鼠的死亡率为50%,且该组大鼠出现显著的体重下降,给药后第一周体重平均下降24±14.75g,伴有明显的黑便。与假手术组大鼠相比,只有黄疸CP大鼠的血清TNF-α水平增高,分别为47.62±14.72 pg/ml和169.61±39.95pg/ml (P=0.000)。而萘普生各治疗组对CP大鼠的血清TNF-α表达无影响。6、大剂量萘普生口服加重CP大鼠的胰腺损伤及纤维化大剂量萘普生(40mg/Kg)口服治疗加重了胰腺损伤,该组大鼠的纤维化及炎症评分均高于溶剂治疗组的CP大鼠。两组CP大鼠的纤维化评分别为2.5±0.5分和1.2±0.4分(P<0.05)。两组CP大鼠的炎症评分分别为2.2±0.8分和1.0±0.0分(P<0.05)。而低剂量萘普生(20mg/Kg)口服和高剂量萘普生腹腔注射组CP大鼠的胰腺病理评分与溶剂治疗组大鼠无明显差别(P>0.05)。大剂量萘普生(40mg/Kg)口服治疗组较溶剂治疗组CP大鼠的VG染色阳性面积增加,分别为(8.89±0.78)%和(5.77±1.65)%(P<0.05)。大剂量萘普生口服增加了胰腺组织中的羟脯氨酸含量,高于溶剂治疗组,分别为821.67±274.96ug/g和534.83±234.34ug/g (P<0.05)。且萘普生的给药途径亦能影响胰腺组织中的胶原含量：腹腔注射萘普生20mg/Kg及40mg/Kg剂量组的VG染色阳性面积分别为(4.51+1.07)%和(6.43±1.94)%,均低于大剂量萘普生口服治疗组(P<0.05)。同样上述两组的羟脯氨酸含量亦低于大剂量萘普生口服给药组,分别为557.04±166.99ug/g和559.38±178.38ug/g (P<0.05)。血浆内毒素和DAO水平的检测在萘普生各治疗组并无差别(P>0.05)。7、大剂量萘普生治疗降低了CP大鼠的腹部热痛阈CP大鼠出现腹部热痛觉高敏感现象。而大剂量萘普生治疗(口服及腹腔给药)降低了CP大鼠的腹部热痛阈值：萘普生40mg/Kg口服治疗组的腹部热痛阈值为5.02±1.54秒,显著低于溶剂口服治疗组的6.52±1.49秒(P<0.05)；萘普生40mg/Kg腹腔注射治疗组的腹部热痛阈值为5.17+1.31秒,显著低于溶剂腹腔注射治疗组的6.67±1.61秒(P<0.05)。而低剂量萘普生治疗(口服及腹腔给药)对CP大鼠的腹部热痛阈值无明显影响(P<0.05)。结论1、TNBS逆行胰胆管注射可成功建立CP热痛觉高敏感大鼠模型。2、PAR2及TRPV1在CP大鼠的背根神经节中表达明显上调；PAR2与大鼠腹部热痛阈值呈显著负相关；急性给予胰蛋白酶抑制剂乌司他丁能以剂量依赖的方式抑制CP大鼠的腹部热痛觉高敏；PAR2可能通过致敏TRPV1受体介导CP痛觉高敏的形成。3、大剂量萘普生口服加重CP模型大鼠的纤维化及胰腺损伤；大剂量萘普生口服非但未发挥止痛效应,反而降低了模型大鼠的腹部热痛阈值；上述效应的产生可能与萘普生所致的肠道损伤、加重组织氧化应激等因素相关。