pH和离子环境对不动杆菌的lysR型调控基因salR的影响

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不动杆菌是一种在自然环境中广泛存在的革兰氏阴性菌,属于假单胞菌目,莫拉氏菌科。Acinetobacter baylyi ADP1菌株是种非致病性细菌,与铜绿假单胞菌和恶臭假单胞菌亲缘关系非常相近,但是它有很强的自然转化能力,使得对它的遗传操作非常简便。在Acinetobacter baylyi ADP1中,水杨酸被羟基化产生邻苯二酚进入β-酮戊二酸途径,然后转化成琥珀酰CoA和乙酰CoA进入三羧酸循环。与水杨酸代谢相关的sal基因全长约30 kb,由四个ORF组成:salA、salR、salD和salE。其中salR基因的表达产物SalR是LysR型转录调控子(LTTR),可以调控salA基因的表达,但对salE基因无效。现已构建了一种生物传感器Acinetobacter ADPWHlux,它将来自发光细菌的无启动子基因簇luxCDABE基因融合于salA基因之后。该菌株经水杨酸诱导后会发出荧光,不需要任何外加条件和底物,而且在一个很广的水杨酸浓度范围内发光度是与其成比例的。本论文对生物传感器的使用条件进行了优化,将细菌置于各种不同pH值和离子的环境中,以模拟细菌在自然界中经常遇到的pH和离子环境胁迫。通过发光度定量分析Acinetobacter baylyi ADP1的salR基因的表达情况,并通过RT-PCR对salA基因转录进行验证。本论文还使用该传感器测定了转双价抗虫CpTI+cry1Ac基因籼稻“MF86”及其亲本水稻“明恢86”在抗虫害过程中叶片内水杨酸浓度的变化,并通过传统的平板计数和DGGE等方法分析了这一过程中转基因抗虫水稻和常规水稻叶围微生物生态群落的变化。结果表明,指数期细菌在pH=5.54-9.05范围内,稳定期细菌在pH=5.79-9.79范围内,salR基因的表达量较稳定,发光度分别保持在各自最高水平的80%和60%以上,而较极端的pH环境会强烈抑制细菌的发光能力。在27种离子环境中,大部分的较高浓度的重金属离子会强烈抑制细菌的生长和发光能力,仅发现Ba2+会促进细菌的发光能力。由于至今缺少对不同pH和离子环境对LTTR系统的活性的影响,本研究有利于进一步揭示LTTR所调控基因表达的特性,也表明该生物传感器对于研究salR基因的调控作用是一个合适而有力的工具。水杨酸生物传感器应用于转基因水稻中有一定的难度,而平板计数和DGGE结果表明,水稻各实验组的叶围细菌的种类基本一致,该部分结果仍需进一步实验的验证。本文优化了生物传感器的使用条件,以利于检测转基因水稻内水杨酸浓度的变化,分析转基因水稻叶围微生物群落结构变化,为转基因水稻的安全性评价提供了理论参考和实验依据。
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