【摘 要】
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将甘露聚糖酶基因、木聚糖酶基因等草本纤维提取所需关键酶基因串联起来,构建成复合酶高效表达的基因工程菌株是确保草本纤维产业持续发展的关键所在。经过对木聚糖酶基因及甘露聚糖酶基因的串联与表达研究获得如下结论:1、采用融合PCR法,对本课题组在Genebank登陆的木聚糖酶基因（EU233656）和甘露聚糖酶基因（DQ364440）进行双基因定向串联研究。将获得的木聚糖酶基因串联体与pMD18-T si
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将甘露聚糖酶基因、木聚糖酶基因等草本纤维提取所需关键酶基因串联起来,构建成复合酶高效表达的基因工程菌株是确保草本纤维产业持续发展的关键所在。经过对木聚糖酶基因及甘露聚糖酶基因的串联与表达研究获得如下结论:1、采用融合PCR法,对本课题组在Genebank登陆的木聚糖酶基因（EU233656）和甘露聚糖酶基因（DQ364440）进行双基因定向串联研究。将获得的木聚糖酶基因串联体与pMD18-T simple vector连接,转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中。经选择性平板筛选,获得约70%阳性克隆。对阳性克隆进行分子生物学鉴定,证明两个木聚糖酶基因串联取得成功。采用DNS法测定其发酵液木聚糖酶酶活未达到理想水平,表明多基因定向串联表达存在较大的难度。2、设计并合成了两对特异性引物,分别从苏云金芽孢杆菌CTC菌株和胡萝卜软腐欧文氏杆菌变异菌株CXJZ95-198扩增出S-层蛋白启动子和β-甘露聚糖酶基因完整开放阅读框（man）;采用SOEing法将它们拼接成基因串联体（slp-man）。将slp-man连接到高效表达载体pET-28a+上,转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中,成功构建了β-甘露聚糖酶基因高效表达体系。3、采用DNS法和水解圈法,对β-甘露聚糖酶基因高效表达体系进行产酶规律分析及表达研究,结果表明,重组菌在11h产酶达到最高峰,发酵液最高酶活达到671.3U/ml,是CXJZ95-198酶活的1.48倍。
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