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本文由以下几部分进行论述: 第一部分:KLF4沉默慢病毒的构建及验证 目的:构建有效沉默KLF4基因的慢病毒。 方法:根据KLF4基因片段特点,设计、合成KLF4-shRNA,然后将KLF4-shRNA与PLVX-shRNA2-Puro质粒载体连接,通过基因测序证实连接正确后,再与辅助载体PMA、SPA共转染293T细胞,构建慢病毒;并将慢病毒转染RAW264.7巨噬细胞检测干扰效率。 结果:经测序证实PLVX-shRNA2-Puro-KLF4-shRNA成功连接,经293T细胞成功包装慢病毒后;流式细胞仪测得重组慢病毒感染滴度为2.12×108TU/mL;RT-PCR证实,慢病毒感染的RAW264.7巨噬细胞中KLF4在mRNA水平基因抑制率达68%。 结论:正确构建了KLF4沉默慢病毒,且制备的慢病毒能有效抑制KLF4基因的表达,为探讨针对KLF4基因沉默对巨噬细胞亚型分化的影响奠定实验基础。 第二部分:KLF4基因沉默对RAW264.7巨噬细胞表型的调控 目的:观察RAW264.7巨噬细胞KLF4基因沉默后亚群的分化。 方法:细胞分为三组,野生型RAW264.7巨噬细胞组(WT组),空白对照组(NC组),沉默KLF4基因的RAW264.7巨噬细胞组(shKLF4组),IL-4分别刺激各组细胞12h,提取各组细胞mRNA,RT-PCR法检测细胞表型标记物iNOS、IL-1β、TNF-α及Arg-1、IL-10、TGF-βmRNA的相对表达量。 结果:1.IL-4干预野生型RAW264.7细胞12h后,IL-4组细胞与WT组相比iNOS、IL-1β及TNF-α基因的mRNA相对表达量明显降低差异均具有统计学意义;IL-4组与WT组细胞Arg-1、IL-10及TGF-β基因的mRNA的相对表达量明显升高,差异均具有统计学意义。2.IL-4干预shKLF4-RAW264.7细胞12h后,shKLF4组与WT组细胞相比iNOS、IL-1β及TNF-α基因mRNA相对表达量明显降低,差异均具有统计学意义。shKLF4组与NC组细胞相比iNOS及TNF-α基因mRNA相对表达量明显升高,而IL-1β基因mRNA相对表达量变化无统计学意义。3.IL-4干预shKLF4-RAW264.7细胞12h后,shKLF4组与WT组细胞相比Arg-1、IL-10及TGF-β基因mRNA的相对表达量均明显升高,差异均具有统计学意义;shKLF4组与NC组细胞相比Arg-1及IL-10明显降低,而TGF-β基因mRNA的相对表达量变化无统计学意义。 结论:KLF4基因沉默后能够刺激巨噬细胞向M1型分化、抑制巨噬细胞向M2型分化。 第三部分:KLF4、单核/巨噬细胞亚群在间质性肺疾病中的变化及可能的作用 目的:初步探讨基于KLF4的单核巨噬细胞亚群调控途径在间质性肺疾病发生发展中的作用。 方法:选取武警后勤学院附属医院2015年5月-2017年1月份住院的间质性肺炎36例作为研究对象,入院后行肺功能检测、动脉血气分析、留取清晨外周血以及支气管肺泡灌洗液,流式细胞术检测外周血单核细胞亚群以及肺泡灌洗液巨噬细胞亚群,ELISA法检测外周血KLF4的表达;观察KLF4的表达量与单核细胞亚群及巨噬细胞亚群分化的关系;并进一步观察单核细胞亚群及巨噬细胞亚群分化与肺功能的关系。 结果:1.间质性肺炎组单核细胞Mon1亚型明显低于对照组(P<0.05),而Mon2亚型及Mon3亚型较对照组升高,且Mon2亚型较对照组明显升高(P<0.05),但相关分析发现单核细胞三个亚型分化比例与患者肺弥散功能及PaO2之间无相关性;2.间质性肺炎组巨噬细胞M1亚型明显低于对照组(P<0.05),而M2亚型则明显高于对照组(P<0.05),且相关分析发现M2亚型分化比例与患者肺弥散功能及PaO2之间呈负相关(P<0.05),即M2亚型比例越高,患者纤维化程度越重;3.KLF4蛋白在间质性肺炎患者外周血表达量明显增高,且KLF4的表达与M2型巨噬细胞的数量呈正相关(ρ=0.378,P=0.122)。 结论:1.CD16+单核细胞在肺纤维化发生、发展中起到一定的作用,但尚无证据表明外周血单核细胞亚群分化与肺纤维化发展的程度直接相关;2.巨噬细胞不同的亚型分化在间质性肺疾病的发生发展中起重要作用,M2型巨噬细胞可能与肺纤维的严重程度呈正相关。3.因此推测KLF4参与的单核巨噬细胞亚群调控可能参与了肺纤维化的发生、发展。