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在全世界范围内,原发性肝癌是第五大常见癌症,其死亡率在所有癌症中高居第三。肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)在原发性肝癌中所占的比例约85%-90%,我国的HCC发病率占全世界的50%以上,HCC已成为威胁我国人口健康的重大疾病之一。流行病学的调查发现,性别差异是HCC发生发展过程中的一个明显特征:在几乎所有的人群中,男性相对女性都具有较高的HCC发病率;在预后方面,男性患者生存率低、生存期短,而女性治疗后具有相对较高的生存率和较低的复发率。目前的研究表明,男性更易患HCC的原因主要有以下几点:(1)男性和女性面对的风险因子的不同;(2)肝脏是个性别二态性的器官,肝脏的基因调控、线粒体功能、微粒酶活性、免疫反应等多方面在男性和女性中存在明显的差异;(3)男性和女性体内激素环境的差异。然而,其中确切的机制还不明确。 移植性模型在肿瘤研究中应用广泛,并具有较好的稳定性和一致性,因而将其作为我们的研究工具。我们的工作在构建的各种小鼠移植性HCC模型的基础上,首先确定了用于实验的动物模型,并基于此,分别在体内和体外水平上对HCC发展过程中性别差异这一现象进行了相应的研究: 1.以不同来源的HCC细胞作为供体,在相应的小鼠中建立了同种原位、异种原位以及异种异位的HCC模型,并比较各模型中雌雄小鼠间HCC肿瘤的生长情况。最终确定以鼠源肝癌细胞H22种植的BALB/c小鼠原位HCC模型为对象,研究HCC发展过程中性别差异现象。结合上述模型及性腺摘除手术,发现雌激素参与了调控HCC发展过程中的性别差异,而雄激素无此作用。并且通过外源补充雌激素进一步证实雌激素可以降低HCC恶性程度。 2.通过对不同实验组中的HCC肿瘤组织进行大量病理分析,发现雌激素可以下调PCNA、CyclinA、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9和Bcl-2的水平,可能通过抑制肝癌细胞增殖和侵袭并促进肝癌细胞凋亡,而发挥其抑制HCC恶性的作用。此外,通过比较正常小鼠肝组织和荷瘤小鼠肿瘤组织中过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ的含量,发现PPARγ在其中可能也发挥了相应的调控作用。 3.雌激素负调控HCC的分子机制的研究主要分为两部分: 一方面,在体外建立模拟体内雌激素给药的细胞模型,并在其中研究了雌激素的作用及相关机制,结果表明: (1)不论是人源还是鼠源HCC细胞中,雌激素产生的效应与组织水平相一致,并显示出明显的量效关系和时效关系。即雌激素确实可以通过降低PCNA、CyclinA和Cyclin D1的水平造成细胞周期阻滞而抑制肝癌细胞增殖;通过下调MMP-2和MMP-9的表达抑制肝癌细胞侵袭;还通过抑制Bcl-2表达诱发线粒体途径的凋亡。 (2)雌激素可以抑制NF-kB的活化。基于此,通过辅以雌激素受体(ERs)特异性的激动剂和拮抗剂为参照,我们确定在HCC发展过程雌激素是通过激活ERα而不是ERβ发挥效应的;进一步通过siRNA降低内源性ERα的表达确证了雌激素通过激活ERα而抑制NF-κB通路。 另一方面,在体外研究了PPARγ在HCC中的作用并揭示了其也参与调控雌激素介导的性别差异,结果表明: (1)通过PPARγ特异性拮抗剂和激动剂的应用,以及过表达PPARγ或者降低内源性PPARγ含量,均证实了PPARγ的活化可以抑制HCC细胞的侵袭能力。 (2)同时,证实了PPARγ的活化可以增加胞内及上清中PAI-1的含量,并抑制上清中uPA的酶活性;结合PAI-1启动子区报告基因的结果证明PPARγ的活化可以直接上调PAI-1的表达量。由此证明,活化的PPARγ通过增强PAI-1的表达抑制uPA酶活而抑制HCC细胞的侵袭能力。 (3)以PPARγ激动剂为对照联合拮抗剂,证明了在HCC细胞中雌激素可以选择性激活PPARγ(与传统的激动剂比,激活效应相对较弱),上调PAI-1表达而抑制HCC细胞的侵袭能力。这一效应也被进一步的PPARγ过表达和干扰RNA实验所证实,说明雌激素可以通过激活PPARγ发挥其在HCC发展的性别差异中的调控作用。 综上所述,我们的实验探讨了HCC发展过程中性别差异这一流行病学现象,首次提出了雌激素具有介导HCC发展性别差异重要功能,其中雌激素可发挥抑制HCC恶性发展的作用。同时,我们也证实雄激素对于HCC的发展并没有明显的促进或抑制作用。本研究在雌激素具有介导HCC发展性别差异这个生物学现象基础之上,还进一步研究了雌激素抑制HCC恶性的分子机制,结果表明:一方面,雌激素通过激活ERα而抑制NF-κB通路及其下游基因的表达而抑制肝癌细胞增殖和侵袭并促进肝癌细胞凋亡;另一方面,雌激素通过选择性激活PPARγ上调PAI-1表达而抑制HCC细胞的侵袭能力。以上研究结果可以为HCC的研究及新药开发提供辅助参考,为HCC治疗中的个体化治疗提供新的提示。