猪肉一直是我国最主要的肉类消费品,随着人们生活水平的提高,瘦肉型猪已不能满足人们对于猪肉口感的要求了,因此近年来研究人员将科研重点转向了提高猪肉品质和口感。通过对具有优良性状的种猪进行主效基因、QTL、SNP、MAS的研究,筛选出影响肌肉或脂肪发育的相关基因。研究表明,LMNA基因能够影响肌肉和脂肪的发育及生成。LMNA即核纤层蛋白,是结合于内层核膜上参与核膜的形成,并维持细胞核的形态,能够调控进出核孔的通道,影响相关转录因子和细胞信号通路的激活与作用。在人类中LMNA基因突变会导致肌肉和脂肪发育,修复和生成相关的遗传病(Laminopathies),在小鼠中LMNA突变和敲除也会引起相似的肌肉或脂肪发育障碍。因此本研究以LMNA基因作为研究对象,构建pc DNA3.1-s LMNA超表达载体和合成LMNA的干扰si RNA序列,分别对C2C12和3T3-L1细胞进行超表达,干扰及分化的实验,以研究LMNA基因对于肌肉和脂肪的发育及生成的影响,为以后实际生产中的猪育种打下一定的基础。取得的主要研究成果如下:1、根据基因重组原理,利用猪的c DNA为模版,将LMNA基因连接到p MD18-T载体上,再以重组p MD18-T-s LMNA载体为模版,以内切酶NheⅠ和KpnⅠ酶切目的片段和pc DNA3.1载体,构建重组超表达载体pc DNA3.1-s LMNA。分别对载体进行测序验证,PCR和酶切验证。分别将超表达载体转染C2C12和3T3-L1细胞并在细胞内稳定表达。2、利用构建的pc DNA3.1-s LMNA超表达载体和苏州吉玛公司合成的LMNA基因si RNA干扰序列分别转染C2C12成肌细胞,另外在超表达和干扰转染同时分别做C2C12细胞的0、2、4、6天分化,收集细胞提取RNA和蛋白做定量PCR和Western Blot实验。结果显示LMNA超表达会引起肌肉相关基因的下调,LMNA干扰会引起肌肉相关基因的上调,C2C12分化过程中干扰LMNA表达会抑制细胞分化。3、利用超表达载体pc DNA3.1-s LMNA和LMNA si RNA干扰序列分别转染3T3-L1细胞,之后超表达和干扰转染后同时分别作3T3-L1细胞的0、2、4、6天分化,收集细胞提RNA和蛋白做定量PCR和Western Blot实验。结果显示超表达LMNA会导致脂肪相关基因表达下降,干扰LMNA会导致脂肪相关基因表达上升,干扰LMNA基因会抑制3T3-L1前体脂肪细胞的分化。4、在C2C12细胞和3T3-L1细胞的超表达LMNA分化实验中,肌肉和脂肪分化相关基因在分化第2天时表达量都出现了不同程度的上升,然而在分化第4、6天表达量又保持平稳或者降低,说明在成肌细胞和前体脂肪细胞分化初期LMNA可能具有一定程度的促进作用,但在分化中后期的结果却相反,具体原因有待进一步研究。