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背景和目的:机体的免疫反应在幽门螺杆菌(Helicobacter pylori, H. pylori)致病和H. pylori疫苗的免疫保护中均起重要作用,因此阐明H. pylori感染的免疫致病机制和H. pylori疫苗的免疫保护机制,对于H. pylori相关性疾病的防治具有十分重要的意义。Th免疫反应在H. pylori感染的免疫致病及疫苗的免疫保护中均起着重要作用。但是H. pylori感染和H. pylori疫苗接种究竟通过何种机制影响Th反应,目前尚不清楚。T细胞免疫球蛋白黏蛋白结构域相关分子(T-cell immunoglobulin and mucin-domain-containing molecule,Tim)是新近发现在T细胞表面的跨膜蛋白家族,它对CD4+T细胞分化成Th1和Th2细胞,调控效应T细胞(Th1和Th2)的应答起着重要作用,Tim-1和Tim-3是Tim家族中的两个重要成员,它们分别在分化成熟的Th2和Th1细胞表达,并参与Th免疫反应的调控。H. pylori感染及疫苗接种对Tim的影响目前尚不清楚,为此本研究在体内外观察了H. pylori感染及疫苗接种后Tim-1及Tim-3的表达,及其与Th1和Th2免疫反应的关系,旨在初步探讨H. pylori感染和H. pylori疫苗接种影响Th反应的机制,为后续以Tim-1和Tim-3为靶点防治H. pylori感染和H. pylori相关性疾病提供理论和实验依据。方法:(1) H. pylori与小鼠脾淋巴细胞共培养:以不同浓度的SS1 H. pylori活菌(0 CFU/ml、0.50×10~7CFU/ml、1.00×10~7CFU/ml、2.00×10~7CFU/ml、4.00×10~7CFU/ml)与原代分离的BALB/c小鼠脾淋巴细胞共培养,分别在3h、6h、12h和24h点收集细胞。(2)小鼠H. pylori感染模型建立和根除治疗:6-8周龄的清洁级的BALB/c小鼠,给予含1.0×10~9/ml的SS1 H. pylori活菌液,0.5ml/只,灌胃,隔日一次,共5次。建立动物模型后,随机分为2组:H. pylori感染组:仅给予药物赋形剂5%阿拉伯树胶溶液;H. pylori根除组:给予洛赛克(质子泵抑制剂,PPI)0.06 mg/次/只,羟氨苄青霉素2.9mg/次/只,克拉霉素1.5 mg/次/只和5%阿拉伯树胶溶液。分别给予上述药物每日2次灌胃,共2周。另设一正常对照组不给予H. pylori和任何药物。停药后4周,处死小鼠,取标本待测。(3) H. pylori疫苗免疫保护接种:6~8周龄的清洁级BALB/c小鼠随机分为以下3组:正常对照组:不接种疫苗也不给予H. pylori攻击;疫苗对照组:PBS溶液;疫苗免疫组:H. pylori抗原+壳聚糖颗粒+CT组,后二组于第0、7、14、21天灌胃各免疫1次,末次免疫后4周给予1.0×109CFU/ml的SS1 H. pylori菌液0.5ml/只进行攻击,隔日一次,共2次。4周后,处死小鼠,取标本待测。(4)各项指标检测:①胃黏膜内H. pylori的检测:采用改良Giemsa染色和H. pylori定量培养;②血清抗H. pylori IgG1、IgG2a和胃黏膜内IL-2、IL-12、IFN-γ、IL-4、IL-10含量的检测:采用间接ELISA法和双抗体夹心ELISA法;③脾和淋巴细胞细胞内Tim-1和Tim-3 mRNA检测:采用RT-PCR方法。④Tim-3阳性细胞检测:采用流式细胞术。研究结果:(1) H. pylori对小鼠淋巴细胞内Tim-1及Tim-3表达的影响:①H. pylori活菌作用小鼠淋巴细胞3h后对小鼠淋巴细胞内Tim-1 mRNA的表达无显著影响(P>0.05),但是在6h、12h和24h时不同浓度的H. pylori活菌作用小鼠淋巴细胞可显著影响其Tim-1 mRNA的表达(P<0.01,0.05,0.001)。在6h和12h时,0.50×10~7CFU/ml和1.00×10~7CFU/ml浓度组显著低于对照组(P<0.05);但是在高浓度(2.00×10~7CFU/ml和4.00×10~7CFU/ml)时,Tim-1 mRNA表达回升,与对照组无差别(P>0.05),并高于低浓度组(P<0.05,0.005)。在24h时,在0.50×10~7CFU/ml至2.00×10~7CFU/ml浓度范围内,随着H. pylori活菌浓度增加,Tim-1 mRNA的表达下降,其中1.00×10~7CFU/ml和2.00×10~7CFU/ml组与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.005);在高浓度组(4.00×10~7CFU/ml),Tim-1 mRNA表达回升,与对照组无差别(P>0.05),并高于低浓度组(P<0.005,0.001,0.001)。②H. pylori活菌作用小鼠淋巴细胞3h和24h后对小鼠淋巴细胞内Tim-3 mRNA的表达无显著影响(P>0.05),但是在6h和12h时不同浓度的H. pylori活菌作用小鼠淋巴细胞可显著影响其Tim-3 mRNA的表达(P<0.01,0.001),随着H. pylori活菌浓度增加,Tim-3 mRNA的表达逐渐升高。在6h时,2.00×10~7CFU/ml和4.00×10~7CFU/ml浓度组显著高于对照组和0.50×10~7CFU/ml浓度组(P<0.005,0.05)。在12h时,2.00×10~7CFU/ml浓度组显著高于对照组、0.50×10~7CFU/ml和1.00×10~7CFU/ml浓度组(P<0.05),而4.00×10~7CFU/ml浓度组显著高于对照组和其它各浓度组(P<0.001,0.05)。③H. pylori活菌作用小鼠淋巴细胞3h后,其Tim-1/Tim-3 mRNA无显著变化(P>0.05);但是作用6h、12h和24h后,不同浓度的H. pylori活菌可显著影响细胞Tim-1/Tim-3 mRNA的比值(P<0.001,0.05,0.001)。在6h时,0.50×10~7CFU/ml和1.00×10~7CFU/ml浓度组显著低于对照组(P<0.05,0.01);在12h时,1.00×10~7CFU/ml浓度组显著低于对照组(P<0.005);在24h时,0.50×10~7CFU/ml、1.00×10~7CFU/ml和2.00×10~7CFU/ml浓度组显著低于对照组(P<0.005,0.001,0.001)。在这3个时间点的高浓度组(4.00×10~7CFU/ml),Tim-1/Tim-3 mRNA的比值回升,与对照组无差别(P>0.05),并且高于低浓度组(P<0.001)。④流式细胞仪检测表明,H. pylori活菌作用小鼠淋巴细胞24h后Tim-3阳性细胞百分比无变化(P>0.05),但是在6h和12h时不同浓度的H. pylori活菌作用小鼠淋巴细胞可显著增加Tim-3阳性细胞的百分比(P<0.05)。在6h时,4.00×10~7CFU/ml浓度组显著高于对照组(P<0.01)和0.50×10~7CFU/ml浓度组(P<0.001),2.00×10~7CFU/ml浓度组显著高于0.50×10~7CFU/ml浓度组(P<0.05)。在12h时,2.00×10~7CFU/ml浓度组显著高于对照组(P<0.05)、0.50×10~7CFU/ml(P<0.005)和1.00×10~7CFU/ml浓度组(P<0.05)。(2)小鼠H. pylori感染和根除后Tim-1及Tim-3表达的变化:H. pylori感染组小鼠脾脏Tim-1 mRNA的表达显著低于正常对照组(P<0.05),H. pylori根除后小鼠脾脏Tim-1 mRNA的表达显著增加,高于感染组(P<0.05),与正常对照组无差别(P>0.05)。H. pylori感染组小鼠脾脏Tim-3 mRNA的表达显著高于正常对照组(P<0.05),H. pylori根除后小鼠脾脏Tim-3 mRNA的表达显著下降,低于感染组(P<0.05),与正常对照组无差别(P>0.05)。H.pylor感染小鼠脾脏Tim-1/Tim-3 mRNA显著低于正常对照组(P<0.05),H. pylori根除后小鼠脾脏Tim-1/Tim-3 mRNA显著增加,高于感染组(P<0.05),与正常对照组无差别(P>0.05)。(3)小鼠免疫保护疫苗接种后Tim-1及Tim-3表达的变化:疫苗免疫组小鼠脾脏Tim-1和Tim-3 mRNA的表达均显著高于正常对照组和疫苗对照组(P<0.001~0.05)。疫苗对照组小鼠脾脏Tim-3 mRNA的表达显著高于正常对照组(P<0.05)。小鼠脾脏Tim-1/Tim-3 mRNA的比值在疫苗对照组显著低于正常对照组(P<0.05),而在疫苗免疫组此比值显著增加,高于疫苗对照组(P<0.001),与正常对照组无差别(P>0.05)。(4)小鼠H. pylori感染和根除后以及H. pylori疫苗接种各组Tim-1及Tim-3与Th免疫反应的关系:1)小鼠H. pylori感染和根除后Tim-1及Tim-3与Th免疫反应:①血清抗H. pylori IgG1和IgG2a含量在H. pylori感染组及H. pylori根除组均显著高于正常对照组(P<0.001,0.01和0.05),在H. pylori感染组与H. pylori根除组之间无显著差异(P>0.05)。并且在各组小鼠脾脏Tim-1 mRNA的表达与血清抗H. pylori IgG1含量(反映Th2免疫反应)呈显著正相关(P<0.001,0.05),与血清抗H. pylori IgG2a含量(反映Th1免疫反应)无相关性(P>0.05);而脾脏Tim-3 mRNA的表达与血清抗H. pylori IgG2a含量呈显著正相关(P<0.01,0.05),与血清抗H. pylori IgG1含量无相关性(P>0.05)。②胃黏膜内IL-4、IL-10和IL-12含量在对照组、H. pylori感染和根除组之间无显著差异(P>0.05),各组间IL-2和IFN-γ含量有显著差异(P<0.01,0.05)。进行两两比较发现,IL-2和IFN-γ含量在H. pylori感染组高于正常对照组和H. pylori根除组(P<0.005,0.01和0.05),H. pylori根除组与正常对照组无差别(P>0.05)。并且各组小鼠脾脏Tim-1 mRNA的表达与胃黏膜内IL-4和IL-10(Th2细胞因子)含量呈显著正相关(P<0.005,0.01和0.05),与IL-2、IFN-γ和IL-12(Th1细胞因子)含量无相关性(P>0.05);而脾脏Tim-3 mRNA的表达与胃黏膜内IL-2、IFN-γ和IL-12含量呈显著正相关(P<0.005,0.05),与IL-4和IL-10含量无相关性(P>0.05)。2)小鼠疫苗接种各组Tim-1及Tim-3与Th免疫反应:①血清抗H. pylori IgG1和IgG2a含量在H. pylori疫苗接种组均显著高于疫苗对照组与正常对照组(P<0.001),血清中抗H. pylori IgG1含量在疫苗对照组还显著高于与正常对照组(P<0.01)。并且在各组小鼠脾脏Tim-1 mRNA的表达与血清抗H. pylori IgG1含量呈显著正相关(P<0.05),与血清抗H. pylori IgG2a含量无相关性(P>0.05);而脾脏Tim-3 mRNA的表达与血清抗H. pylori IgG2a含量呈显著正相关(P<0.001,0.05),与血清抗H. pylori IgG1含量无相关性(P>0.05)。②疫苗接种各组间胃黏膜内IL-4含量无显著差异(P>0.05);IL-10、IL-2、IFN-γ和IL-12含量有显著差异(P<0.001,0.005),疫苗免疫组均高于正常对照组和疫苗对照组(P<0.001,0.005和0.05),IFN-γ和IL-12含量在疫苗对照组显著高于正常对照组(P<0.01和0.05),IL-10含量在疫苗对照组显著低于正常对照组(P<0.05)。并且在各组小鼠脾脏Tim-1 mRNA的表达与胃黏膜内IL-4和IL-10含量呈显著正相关(P<0.001,0.005,0.01和0.05),与IL-2、IFN-γ和IL-12含量无相关性(P>0.05);而脾脏Tim-3 mRNA的表达与胃黏膜内IL-2、IFN-γ和IL-12含量呈显著正相关(P<0.005,0.01和0.05),与IL-4和IL-10含量无相关性(P>0.05)。结论:1. H. pylori在体外可下调小鼠淋巴细胞Tim-1的表达,上调Tim-3的表达,并降低Tim-1/Tim-3比值,提示它可抑制T淋巴细胞向Th2细胞分化,促进T淋巴细胞向Th1细胞分化,诱导Th1优势的免疫反应。2.在体内H. pylori感染能下调小鼠脾脏内Tim-1的表达,上调Tim-3的表达,使Tim-1/Tim-3比值下降,而H. pylori根除后Tim-1表达回升,Tim-3表达下降,Tim-1/Tim-3比值上升,提示H. pylori感染可诱导Th1优势的免疫反应,而H. pylori根除后可逆转H. pylori感染所致的Th1优势的免疫反应。3. H. pylori疫苗接种后可上调小鼠脾脏Tim-1和Tim-3 mRNA的表达,使Tim-1/Tim-3比值上升,提示H. pylori疫苗接种可诱导Th1和Th2混合免疫反应,并可逆转H. pylori感染所致的Th2反应抑制,恢复Th1/Th2免疫反应的平衡。4.在H. pylori感染和疫苗接种各组Tim-1的表达与反映Th2免疫反应的抗H. pylori IgG1含量和Th2细胞因子含量呈正相关,而与反映Th1免疫反应的抗H. pylori IgG2a含量和Th1细胞因子含量无显著相关性;Tim-3的表达则反之,说明在H. pylori感染和疫苗接种时Tim-1和Tim-3的表达能较好的反映Th2和Th1免疫反应,这为后续以Tim-1和Tim-3为靶点防治H. pylori感染和H. pylori相关性疾病提供了依据。