两种钛银合金表面改性后的抗菌性和生物相容性研究

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目的:金属钛和钛基合金凭借其优良的耐腐蚀性、高机械强度和细胞相容性被广泛应用为各式的骨科植入物材料。除此之外,这些材料还具有优越的疲劳强度、高耐磨性,以及与天然人体骨相似的杨氏模量。然而,骨科术后植入物相关感染和无菌性松动是骨科术后的2个主要挑战。骨科术后植入物相关感染的发病机制是细菌粘附在内植物表面、增殖以及随后形成生物膜。形成的生物膜可以保护细菌免受宿主免疫系统和抗生素治疗的影响,从而导致植入物相关感染。而假体与骨组织之间的结合失败则可导致无菌性松动。但是,目前骨科常用的植入物材料-钛缺乏抗菌能力和促骨整合性能。因此,迫切需要设计一种金属植入物,可以同时防止植入物相关感染并且还促进骨整合以防术后无菌性松动。目前为了防治植入物相关感染的主要策略是通过离子注入,等离子喷涂,阳极氧化和抗生素涂层或抗菌聚合物对金属钛表面进行改性。其中无机抗菌金属银与传统抗生素相比,具有抗菌谱广、形成抗性菌株的可能性小,细胞毒性低和生理条件下令人满意的稳定性的特点。因此已被应用于部分临床中的医疗产品和器械中。在赋予金属钛抗菌性的方法中,除了用抗菌金属银离子或纳米银颗粒对金属钛表面进行改性之外,减少细菌感染发生的另一个重要策略是在金属钛中掺入具有抗菌能力的金属银。增强金属钛的骨整合能力的表面改性方法有很多。其中的酸蚀和碱处理是一种低成本的,有效的和再现度高的表面改性方法。通过酸蚀和碱处理后材料表面将形成独特的微米,亚微米和纳米复合结构。在本研究中,分别通过放电等离子烧结方法和铸造的方法制备钛银合金,之后对表面进行酸蚀或和碱处理进行表面改性。重点评价2种表面改性后的钛银合金的表征、抗菌性能、生物相容性及促成骨能力。研究方法:分别通过放电等离子烧结方法和铸造方法制备2种钛银合金。对前者予以氢氟酸和硝酸混合酸蚀处理(Ti-Ag(AE)),对后者予以盐酸酸蚀和氢氧化钠碱处理(Ti-Ag(CT))。之后,系统的评价各样品的表面特征、离子释放情况、抗菌性能、生物相容性和促成骨性能等。通过场发射扫描电镜观察样品表面形貌;通过能量色散X射线谱和X射线衍射分析表面化学组成;通过共聚焦激光扫描显微镜测定表面粗糙度;通过接触角的测定评价样品表面亲水性;通过银离子释放测定,电化学分析和pH测定来研究样品抗菌机制;通过平板涂布计数法分别检测样品1天和30天后的抗菌能力;通过活死细菌荧光染色和扫描电镜观察共培养1天后的细菌活性和细菌粘附程度;通过鬼笔环肽和DAPI染色检测细胞的粘附情况;通过MTT或CCK-8方法对细胞活性和细胞增值情况进行分析;通过检测碱性磷酸酶活性、成骨相关基因的表达水平和细胞外基质矿化水平来评价样品的促成骨能力;通过构建大鼠股骨与内植物相关的骨髓炎感染模型,采用X线拍摄和内植物取出滚板来评价样品在动物体内的抗感染作用。结果:采用放电等离子烧结方法制备的钛银合金在酸蚀处理之后,在Ti-Ag(AE)样品的表面上形成微坑和具有高银含量颗粒,Ti-Ag(AE)样品表面上的颗粒含有显著高于基底的银含量,并且由Ti2Ag和Ti-Ag金属间化合物组成。钛银烧结合金酸蚀处理后的粗糙度明显增加(p<0.01),且经酸蚀处理钛银烧结合金的亲水性大于未酸蚀的样品(p<0.05),除了Ti-5Ag(AE)。在银离子释放方面,Ti-Ag(AE)样品最初释放出大量的银离子,然后释放量逐渐减少,释放量均高于未酸蚀的钛银烧结合金。电化学实验结果显示Ti-Ag(AE)样品具有比cp-Ti和s-Ti(AE)样品更好的耐腐蚀性,但耐腐蚀性比钛银烧结合金样品差。在体外抗菌性实验中,通过平板涂布法检测,与没有酸蚀的钛银烧结合金样品相比,酸蚀过的钛银烧结合金样品无论在第1天还是磷酸盐缓冲盐水中浸泡30天后都具有显著更好的抗菌率(p<0.01),其中Ti-3Ag(AE)和Ti-5Ag(AE)即使在浸泡30天后的抗菌率仍分别保持在96.53%和99.04%。活死细菌荧光染色和扫描电子显微镜下观察结果皆证实,Ti-3Ag(AE)和Ti-5Ag(AE)样品不仅可以有效杀灭粘附的细菌,还可以防止细菌粘附。在体外生物相容性实验中,MC3T3-E1细胞的细胞活力和增殖结果显示Ti-Ag(AE)样品无细胞毒性,但也没有促进细胞增殖的能力(p>0.05)。通过场发射扫描电子显微镜发现在细胞与样品共培养1天后,酸蚀处理过的样品会伸出更多的伪足,而共培养三天后各样品之间的形态差异并不明显。在cp-Ti和Ti-Ag(AE)之间的碱性磷酸酶活性并无无统计学差异(p>0.05),表明Ti-Ag(AE)对细胞分化没有影响。采用铸造方法制备的钛银合金在酸蚀和碱处理(合称化学处理)之后,Ti-Ag(CT)样品的表面显示出微米级、亚微米级和纳米级混合复合结构和微米级与亚微米级颗粒。通过能量色散X射线光谱可分析出,碱处理导致在Ti-Ag样品酸蚀处理后的表面上形成具有高银含量的颗粒。X射线衍射检测到在化学处理的样品上存在ɑ-Ti和TiH2。Ti-Ag(CT)样品的粗糙度和亲水性显著高于cp-Ti样品(p<0.01)。Ti-1Ag(CT),Ti-3Ag(CT)和Ti-5Ag(CT)样品第1天的银离子释放量分别为21.20±4.92,45.37±4.56和145.17±11.70ppb。钛银样品在第1天释放相对大量的银离子,然后释放量逐渐减少,在7天后达到稳定。且第一天的pH值均在6-7范围内。在体外抗菌性实验中,通过平板涂布法检测,Ti-3Ag(CT)和Ti-5Ag(CT)样品无论在第1天还是磷酸盐缓冲盐水中浸泡30天后都具有显著更好的抗菌率(p<0.01),其中Ti-3Ag(AE)和Ti-5Ag(CT)即使在浸泡30天后的抗菌率仍依然保持在90%以上。活死细菌荧光染色和扫描电子显微镜下观察结果皆证实,Ti-3Ag(CT)和Ti-5Ag(CT)样品不仅可以有效杀灭粘附的细菌,还可以防止细菌粘附。在体外细胞实验中,Ti-Ag(CT)样品比在cp-Ti样品上粘附的细胞更多(p<0.05),且表现出来更多的细胞质延伸,更多的丝状伪足和片状伪足。但在细胞增殖方面cp-Ti和Ti-Ag(CT)样品之间没有统计学差异。但通过对相对生长速率的计算证实Ti-Ag(CT)样品都没有细胞毒性。在促进细胞成骨的实验中,成骨诱导7天后,Ti(CT),Ti-1Ag(CT)和Ti-3Ag(CT)样品的碱性磷酸酶活性均高于cp-Ti样品(p<0.05)。在成骨相关基因表达方面,Ti-Ag(CT)可以促进前成骨细胞碱性磷酸酶,1型胶原蛋白和骨钙素基因的表达。除此之外,Ti-Ag(CT)还可以促进细胞外基质矿化。在动物体内实验中,术后7天和42天的X光影响均可在cp-Ti组发现内植物感染的征象,而在Ti-3Ag(CT)组中则无任何感染征象。而且cp-Ti组内植物取出后滚板培养会有大量菌落形成,而Ti-3Ag(CT)组内植物取出后滚板培养无菌落形成。结论:采用放电等离子烧结系统制备钛银烧结合金样品。酸蚀前的钛银烧结合金样品的抗菌率有限且不令人满意。在酸蚀处理之后,在Ti-Ag(AE)样品的表面上形成微坑和具有高银含量颗粒,并且Ti-3Ag(AE)和Ti-5Ag(AE)样品显示出优异的抗菌性能。即使浸泡30天后,Ti-3Ag(AE)和Ti-5Ag(AE)样品仍显示出高于96%的抗菌率,表明它们具有长期有效的抗菌性。此外,Ti-3Ag(AE)和Ti-5Ag(AE)样品也表现出良好的生物相容性。采用铸造的方法制备钛银铸造合金样品。化学处理后钛银铸造合金表面形成了微米和亚微米混合孔隙、海绵状纳米结构和含银颗粒。Ti-1Ag(CT)、Ti-3Ag(CT)和Ti-5Ag(CT)样品在24小时内显示出强抗菌性能,这归功于银离子释放和含银颗粒。Ti-3Ag(CT)和Ti-5Ag(CT)样品在浸泡30天后仍保持抗菌性,这主要归功于含银颗粒。此外,Ti-1Ag(CT)和Ti-3Ag(CT)样品由于其特殊的表面形貌,在细胞粘附和成骨分化方面均表现出促进作用。Ti-3Ag(CT)在动物体内也可起到抗感染作用。
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