本文主要从以下几方面展开论述：　　第一部分 Etfdh(h)c.250 G＞A基因敲入RR-MADD小鼠模型的建立及其病理机制研究　　背景：　　多种酰基辅酶A脱氢缺陷(Multiple acyl-coenzyme A dehydrogenationdeficiency，MADD)，又称戊二酸尿症Ⅱ型。是一种常染色体隐性遗传的脂肪酸代谢障碍疾病。MADD的临床表现多样，通常被分为三型:Ⅰ型为伴有先天性畸形的新生儿型;Ⅱ型为不伴有先天性畸形的新生儿型;Ⅲ型为晚发型。晚发型多种酰基辅酶A脱氢缺陷为中国人群中最常见的类型，以肌无力，运动不耐受，肝肿大，发作性呕吐，低血糖及代谢性酸中毒为主要特征。在晚发型MADD中，高剂量核黄素治疗对其中部分患者具有戏剧性的治疗作用，我们将这一类型MADD称为核黄素反应性MADD(riboflavin-responsive MADD，RR-MADD)。　　目的：　　为了解决这些问题，我们首次建立了携带人类p.A84T(c.250G＞A)点突变的Etfdh基因敲入小鼠，并利用小鼠模型分析了ETFDH基因突变导致RR-MADD发病的具体分子机制;通过分析核黄素治疗前后小鼠各项病理指标和生化指标变化，探讨核黄素纠正遗传代谢缺陷的作用机制。　　方法：　　1.构建基因打靶技术需要的基因敲入载体:本载体设计通过基因打靶技术，在小鼠第3号外显子，精确引入与中国人群ETFDH c.250G＞A热点突变相同的引起氨基酸p.A84T改变的突变。　　2.基因敲入载体导入胚胎干细胞，经过筛选获得发生正确同源重组的胚胎干细胞。　　3.制备嵌合型小鼠:将获得的发生正确同源重组的ES细胞显微注射入C57BL/6小鼠的囊胚中，经注射的囊胚在假孕母鼠的子宫中生长，成为嵌合型小鼠。　　4.获得Etfdh(h) c.250G＞A突变杂合子小鼠:嵌合体小鼠与另一只C57BL/6小鼠交配，产生出后代。用PCR方法筛选出Etfdh(h) c.250G＞A基因敲入小鼠，这些小鼠被称为F1代。将F1代小鼠与CMV-Cre小鼠杂交，以去除插入的Neo元件。　　5.Etfdh(h) c.250G＞A突变杂合子小鼠互交，获得Etfdh(h)c.250G＞A(p.A84T)突变纯合子小鼠及其同窝对照鼠。　　结果：　　1.Etfdh(h)A84T/+杂合小鼠互相交配，成功获得294只后代小鼠。其基因型分布情况符合孟德尔遗传定律。证明该位点纯合突变并非胚胎致死性突变。　　2.未经饮食诱导的纯合子小鼠不表现MADD特征。　　3.经HF-B2D饮食诱导的基因敲入纯合子小鼠表现类似人类MADD特征。HF-B2D组纯合子小鼠体重明显减轻，且其中位生存期明显缩短。血酰基肉碱检测显示中长链酰基肉碱升高，而短链酰基肉碱和游离肉碱减少;肝脏肿大，肝脏脂肪化;肌肉病理切片H&E染色显示肌纤维直径减小，肌内膜明显增生，ORO染色示小鼠肌纤维内脂滴增多，SDH氧化酶活性较对照组降低。而其它饮食组纯合子小鼠体重、生存期、血酰基肉碱、肝脏病理及肌肉病理均未见明显异常。　　结论：　　在此，我们首次建立了Etfdh(h)p.84A＞T基因敲入小鼠模型，这使得在体研究RR-MADD的发病机制成为可能。最终，纯合子小鼠表现出类似人类MADD的临床特征，核黄素对其症状有戏剧性的治疗效果。　　在我们的研究中，HF-B2D饮食创造了一种低核黄素-高脂肪酸氧化压力的状态，最终成功诱导纯合子小鼠表现出与人类RR-MADD相似的症状。既往的营养学流行病学调查结果显示，亚临床核黄素缺乏状态在人群中是非常常见的，尤其是在青少年女性中更为普遍;而寒冷、饥饿和疾病都可以导致脂肪酸氧化压力升高。因此，在人群中，核黄素-高脂肪酸氧化压力状态并非罕见。当携带与RR-MADD相关ETFDH基因突变的患者出现这种核黄素-高脂肪酸氧化压力状态时，即表现出RR-MADD相关症状。　　在补充核黄素的条件下，体内FAD浓度上升，一方面增加了FAD参与蛋白折叠的机会，另一方面促进了分子伴侣介导的蛋白成熟，从而增强了黄素蛋白的折叠。另外，在补充核黄素后，与FAD结合增强的成熟黄素蛋白在降解的过程中可以向线粒体基质里释放更多的FAD，因此，在停止核黄素供给后，仍能保持FAD池的充盈。这也部分的解释了为什么在临床上只需2-3个月的核黄素补充就可以纠正RR-MADD的症状，而不需终身服药。　　第二部分 柱状螺旋体肌病病理机制的研究　　目的：　　柱状螺旋体(Cylindrical spirals，CSs)是一种肌纤维内极为罕见的病理结构。直至今天，全世界范围内只报道了16例相关病例。肌肉内的柱状螺旋体在组织化学染色及电镜检查中表现很特异。光镜下表现为以Ⅱ型纤维为主的肌纤维内或肌纤维膜下的物质蓄积:其在苏木素-伊红(H&E)染色下呈现碱性，在改良格莫瑞三色(mGT)染色下呈现红色，在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸四唑还原酶(NADH-TR)染色下呈现深染或轻微着色，在肌原纤维腺苷三磷酸酶(ATPase)染色下不着色。电镜检查中，柱状螺旋体表现更为特异，其中心为含有糖原颗粒的中央孔，6-30层板层结构围绕中央孔程螺旋状排列。　　与其病理改变的特异性不同，肌肉活检发现肌纤维内含有柱状螺旋体的患者的临床症状表现极为多样，因此，有些学者认为柱状螺旋体是肌纤维内代谢失衡所导致的反应性改变。但是，患者中肌肉系统相关症状是相对一致的，且柱状螺旋体也曾在家族中集中出现。这些证据暗示了肌纤维内柱状螺旋体的出现也可能是一种原发病理改变，且与遗传因素相关。　　方法：　　1本研究纳入2位柱状螺旋体肌病患者，2名微管聚集肌病患者及2名正常对照。　　2对所有入组患者和对照的肌肉活检组织行常规化学染色，观察其肌肉病理学改变。　　3应用一系列抗细胞内膜系统抗体（包括SERCA1，calsequestrin，RYR1，GM130，myosin，emerin，LC3，lamp2，dystrophin，desmin等），对肌肉活检组织切片行肌肉组织免疫化学/荧光染色，以探究其起源。　　4肌肉组织行透射电镜检查，明确其电镜学改变。　　5从肌肉组织内提取DNA，行相关基因（STIM1，STIM2，ORAI1）突变检测。　　结果：　　1我们报道了国内首例肌纤维内存在柱状螺旋体的病例:患者1、2为同胞姐妹，主要临床表现均为逐渐进展的双侧不对称的肌无力及运动不耐受。肌无力从下肢进展到上肢，从远端发展到近端，左侧重于右侧。CK正常，肌电图表现肌源性损害。双下肢肌肉CT检查结果显示左侧臀大肌和股外侧肌萎缩;双侧胫前肌及腓肠肌脂肪浸润。　　2两位患者肌肉活检常规染色均可见肌膜下异常物质蓄积。其在H&E染色下呈现碱性，mGT染色下呈现红色，NADH-TR染色浅染，PAS略着色，ATPase、SDH、CCO染色均不着色。　　3两位患者的肌肉标本电镜检查均显示其肌纤维膜下存在典型的柱状螺旋体。　　4与微管聚集肌病相比较，柱状螺旋体聚集区域只在抗SERCA1抗体染色显示阳性，而在抗calsequestrin和抗RYR1染色中均为阴性，说明柱状螺旋体来源于肌浆网的长管区。而微管对抗SERCA1、calsequestrin和RYR1抗体染色全部为阳性反应，说明聚集的微管来源于整个肌浆网。　　5基因筛查显示两位患者均不含STIM1、STIM2和ORAI1基因突变。　　结论：　　本研究报道了中国人群中首例肌肉病理活检发现肌纤维内存在柱状螺旋体聚集的病例，并首次提出了柱状螺旋体来源于肌浆网长管区的证据。尽管柱状螺旋体和微管聚集在组织化学染色结果中存在相似性，但我们的研究明确了这两种结构之间成分的差异。肌纤维内的柱状螺旋体对肌浆网长管区蛋白SERCA1具有高度免疫反应性，而对肌浆网交界区蛋白RYR1和calsequestrin没有免疫反应性，这表明其来源于肌浆网的长管区。而微管聚集对所有区域的肌浆网蛋白质（包括SERCA1，RyR1和calsequestrin）都具有免疫反应性，这表明其来源于整个肌浆网。这一结果对临床肌肉病理检查意义重大，其使得临床鉴别微管聚集和柱状螺旋体肌病无需依赖电镜，通过免疫荧光染色即可区分。有趣的是，尽管在所有这些患者中，柱状螺旋体H&E和mGT染色结果高度一致，但其NADH活性却大相径庭。我们回顾了之前发表的柱状螺旋体肌病的文献，总结了NADH-TR染色和临床病理学之间的相关性:柱状螺旋体NATH-TR浅染的所有6例患者均患有肌肉无力，其伴或不伴肌痛，但均不表现痉挛和肌张力增加。相反，在其他4例NADH-TR深染的患者中，只有1例患有阵发性肌无力和肌痛，另外2例则表现为痉挛或肌张力增高，另1例无症状。之前已有研究证实，在骨骼肌中，NADH可以刺激附近的正常RyR1通道活性从而激发Ca2+释放，这将进一步导致肌肉收缩。这种生理机制可以部分解释NADH活性低的患者存在肌肉无力，而NADH活性高的患者表现为痉挛或肌强直的原因。这种NADH活性与其临床表型之间的关系进一步提示了NADH活性在柱状螺旋体肌病发生发展过程中有重要作用，这为柱状螺旋体肌病的治疗提供了重要线索。