目的：　　 中药致肝损伤临床报道逐年增多，已成为了中药临床安全用药的主要问题之一，中药致肝损伤也是中药新药研发安全性研究的主要内容。针对这个问题，早期快速评价中药的肝脏毒性已成为中药研究亟待解决的关键技术问题之一，因此探索检测早期、敏感的肝毒性生物标志物成为研究的热点。本论文以已知肝毒性中药黄药子和课题组筛选的具有肝毒性的中药山豆根致肝损伤模型为研究对象，对文献报道在临床或动物实验中比常规肝功能检测指标变化具有早期性的血清生化指标进行筛选，同时采用现代科学技术-miRNA芯片和代谢组学对肝损伤早期变化特征进行研究，以期寻找肝毒性的早期生物标志物。　　 方法：　　 1.血清生化指标的筛选　　 1.1黄药子致肝损伤早期血清生化指标的筛选　　 1.1.1取大鼠灌胃给予黄药子醇提物3g/kg和5g/kg，分别于给药后1d、7d和16d腹主动脉取血，采用全自动生化仪测定常规血液生化指标ALT、AST、TB、ALP、TP、ALB、TC、TG、HDL、LDL。对文献报道的早期敏感指标TBA采用全自动生化仪进行检测，α-GST、ArgI、ASAL、PA、XOD、ICD、SDH和OCT采用ELISA进行检测。称肝重，计算肝脏指数并进行HE染色观察肝组织病理形态学的变化。　　 1.1.2另取一批大鼠，灌胃给予黄药子醇提物5g/kg，分别于给药后3d、7d、14d、28d和恢复期处理，检测常规肝功能生化指标及筛选出的早期敏感血清生化指标-TBA，同时称肝重，计算肝脏指数并进行HE染色观察肝组织病理形态学的变化。　　 1.2山豆根致肝损伤早期血清生化指标的筛选　　 1.2.1取大鼠灌胃给予山豆根水煎液6g/kg和12g/kg，分别于给药后1d、7d和16d处理，处理方法及检测指标同1.1.1。　　 1.2.2另取一批大鼠，灌胃给予山豆根水煎液12g/kg，分别于给药后3d、7d、14d、28d和恢复期处理，处理方法及检测指标同1.1.2。　　 1.3 TBA在组织中的含量检测　　 取正常动物心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺7个脏器制备10％组织匀浆，对黄药子和山豆根筛选出的早期敏感指标进行组织含量的测定。　　 2.外周血miRNA的筛选　　 2.1黄药子致肝损伤早期外周血miRNA的筛选　　 取1.1.2试验空白对照和药物组动物7d、14d和28d各2ml全血，采用EDTA抗凝后用于miRNA芯片检测。采用GenePix pro V6.0筛选各时间点差异表达miRNA;采用targetscan和DAVID数据库先行对7d差异表达miRNA及在14d和28d仍表现为差异表达miRNA进行靶基因预测和pathway分析，并采用RT-PCR对差异表达高峰在7d的部分miRNA进行外周血和肝组织表达的验证。　　 2.2山豆根致肝损伤早期外周血miRNA的筛选　　 取1.2.2试验空白对照和药物组动物7d、14d和28d各2ml全血，采用EDTA抗凝后用于miRNA芯片检测。数据分析处理及验证方法同2.1。　　 3.血清和尿液内源性代谢产物的筛选　　 3.1黄药子致肝损伤早期血清和尿液内源性代谢产物的筛选　　 取1.1.2试验空白对照和药物组动物3d、7d、14d、28d及恢复期血清和尿液样本，通过核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance，NMR)检测采集1HNMR代谢谱，采用主成分分析(Principal components analysis，PCA)、偏最小二乘判别分析(Partial-least-squares discriminant analysis，PLS-DA)和正交偏最小二乘判别分析(Orthogonal partial least-squares-discriminant analysis，OPLS-DA)多元统计分析的模式识别，寻找对区分不同组别贡献率大的差异代谢产物，鉴定差异代谢产物的结构。结合京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，kegg)分析代谢产物的代谢途径，以筛选肝损伤早期差异代谢产物。　　 3.2山豆根致肝损伤早期血清和尿液内源性代谢产物的筛选　　 取1.2.2试验空白对照和药物组动物3d、7d、14d、28d及恢复期血清和尿液样本，检测及数据分析方法同3.1。结果　　 1.血清生化指标的筛选　　 1.1黄药子致肝损伤早期血清生化指标的筛选　　 1.1.1常规血清生化、肝脏指数和肝组织病理学及早期血清生化指标的筛选　　 与同时间空白对照组相比，黄药子给药后常规血清生化指标TB的变化较为明显，其中低剂量组7d和16d升高(P＜0.05)，高剂量组7d有升高趋势，16d升高(P＜0.05)；肝脏指数低剂量组于16d升高(P＜0.05)，高剂量组于给药7d和16d持续升高(P＜0.05或0.01)；组织病理学检查显示低剂量肝组织无明显变化，高剂量组给药16d出现肝细胞变性肿大和点状坏死。早期血清生化指标的筛选研究发现，TBA的变化较为明显，低剂量组于给药7d和16d有升高趋势(P＞0.05)，高剂量组于给药1d-16d升高（P＜0.05或0.01），呈现明显的时效和量效关系。黄药子高低剂量组血清TBA的变化均比常规生化TB、肝脏指数和组织形态学变化的时间要早，且TBA与同时间点空白对照组的变化倍数高于常规生化指标TB与同时间点空白对照组的变化倍数，其水平的升高与肝组织病理学的改变趋势一致。　　 1.1.2血清TBA与常规血清生化指标、肝脏指数和肝组织病理学的比较　　 与同时间空白对照组相比，早期血清生化指标TBA于给药7d-28d升高(P＜0.05或0.01)，停药7d后恢复正常。黄药子给药后常规生化指标TB的变化较为明显，TB于给药后3d-28d升高（P＜0.01），停药后7d恢复正常；肝脏指数3d-28d升高(P＜0.01)，停药后7d亦显著升高（P＜0.01）；组织病理学检查显示肝组织于7d开始出现点状坏死，随给药时间延长，病理学损伤加重，停药7d肝细胞变性肿大恢复，点状细胞坏死未恢复。经比较显示，TBA能在肝损伤早期升高，且TBA与同时间点空白对照组的变化倍数高于常规生化指标TB与同时间点空白对照组的变化倍数，其水平的升高与肝组织病理学的改变趋势一致。　　 1.2山豆根致肝损伤早期血清生化指标的筛选　　 1.2.1常规血清生化、肝脏指数和肝组织病理学及早期血清生化指标的筛选　　 与同时间空白对照组相比，山豆根给药后常规生化指标ALT的变化较为明显，其高低剂量组均于给药7d和16d升高（P＜0.05或0.01）；肝脏指数给药期间变化不明显(P＞0.05)；组织病理学检查显示低剂量肝组织无明显变化，高剂量组给药16d个别动物出现点状坏死。早期血清生化指标的筛选研究发现，TBA的变化较为明显，与同时间对照组相比，低剂量组于给药1d和16d升高(P＜0.01)，高剂量组于给药16d升高(P＜0.01)，TBA与同时间点空白对照组的变化倍数高于常规生化指标ALT与同时间点空白对照组的变化倍数，其水平的升高与肝组织病理学的改变趋势一致。　　 1.2.2血清TBA与常规血清生化指标、肝脏指数和肝组织病理学的比较　　 与同时间空白对照组相比，TBA于给药3d-28d有持续升高的趋势，停药28d后恢复正常，山豆根给药后常规生化指标ALT的变化较为明显，其于给药7d-28d升高(P＜0.05)，停药28d恢复正常；肝脏指数于给药3d和28d升高(P＜0.01)，其他时间点趋于正常水平，停药后恢复正常；组织病理学检查显示肝组织于28d个别动物出现肝细胞变性肿大，其余各组肝组织均无明显变化，停药28d肝细胞变性肿大恢复。经比较显示，TBA在肝损伤早期升高，且TBA与同时间点空白对照组的变化倍数高于常规生化指标ALT与同时间点空白对照组的变化倍数，其水平的升高与肝组织病理学的改变趋势一致。　　 1.3 TBA在组织中的含量检测　　 TBA在肝脏中的含量较高。　　 2.外周血miRNA的筛选　　 2.1黄药子致肝损伤早期外周血miRNA的筛选　　 在外周血miRNA芯片检测中，7d差异表达上调miRNA有97个，下调有106个，14d差异表达上调miRNA有159个，下调有121个，28d差异表达上调miRNA有89个，下调有83个，对其中7d差异表达而在14d和28d仍表现为差异表达的miRNA通过靶基因预测和pathway分析发现，参与调控信号转导、细胞间的连接、细胞骨架、免疫相关细胞内吞的差异表达的miRNA可能参与了肝损伤的进程。时效高峰在7d的miR-130a、miR-23a、miR-128和miR-142-5p的RT-PCR验证显示，除miR-128外周血和的肝组织表达趋势一样及肝组织中的表达量低外，miR-130a、miR-23a和miR-142-5p外周血和的肝组织的表达基本一致。　　 2.2山豆根致肝损伤早期外周血miRNA的筛选　　 在miRNA芯片检测中，7d差异表达上调miRNA有11个，下调有1个，14d差异表达上调miRNA有22个，下调有13个，28d差异表达上调miRNA有13个，下调有2个，对其中7d差异表达而在14d和28d仍表现为差异表达miRNA通过靶基因预测和pathway分析发现，参与调控信号转导通路、细胞间的连接、细胞骨架、免疫相关细胞内吞的差异表达的miRNA可能参与了肝损伤的进程。时效高峰在7d的miR-291a-5p、miR-142-5p的RT-PCR验证显示，miR-291a-5p、miR-142-5p外周血和肝组织的表达基本一致。　　 3.血清和尿液内源性代谢产物的筛选　　 3.1黄药子致肝损伤早期血清和尿液内源性代谢产物的筛选　　 在肝损伤的早期(3d或7d)，血清中能检测到葡萄糖、低密度脂蛋白、胆固醇和胆汁酸及谷氨酸的变化。尿液中能检测到丙酮酸、乳酸、乙酰乙酸、丙氨酸、谷氨酸、N-乙酰谷氨酸和牛磺酸的变化。　　 3.2山豆根致肝损伤早期血清和尿液内源性代谢产物的筛选　　 在肝损伤的早期(3d或7d)，血清能检测到谷氨酰胺、谷氨酸的变化。尿液中能检测α-酮戊二酸、琥珀酸、丙氨酸、乙酰乙酸、N-乙酰谷氨酸的变化。　　 结论：　　 1、早期血清生化指标的筛选中，初步认为TBA在黄药子和山豆根致肝损伤中，能早期、敏感的提示肝脏损伤，且TBA的在肝脏中的含量较高，肝组织特异性较强，检测方法简便，稳定，TBA可作为肝损伤的早期敏感指标之一。　　 2、外周血的miRNA的筛选中，采用miRNA芯片技术和RT-PCR验证研究提示miR-130a、miR-23和miR-142-5p可作为黄药子致肝损伤早期敏感指标之一，miR-291a-5p和miR-142-5p可作为山豆根致肝损伤早期敏感指标之一，miR-142-5p是黄药子和山豆根致肝损伤的共同早期敏感指标之一。　　 3、血清和尿液内源性代谢产物的筛选中，采用代谢组学技术研究提示葡萄糖、低密度脂蛋白、胆固醇及胆汁酸（与糖脂代谢相关）和谷氨酸（与氧化应激相关）可作为黄药子致肝损伤的早期血清标志物之一；丙酮酸、乳酸、乙酰乙酸及丙氨酸（与三羧酸循环能量代谢相关），谷氨酸及N-乙酰谷氨酸（与氧化应激相关）和牛磺酸（与胆汁酸代谢相关）可作为黄药子致肝损伤的早期尿液标志物之一。谷氨酰胺、谷氨酸（与氧化应激相关）可作为山豆根致肝损伤的早期血清标志物；α-酮戊二酸、琥珀酸、丙氨酸及乙酰乙酸（三羧酸循环能量代谢相关）和N-乙酰谷氨酸（与氧化应激相关）可作为山豆根致肝损伤的早期尿液生物标志物之一。谷氨酸（与氧化应激相关）可作为黄药子和山豆根致肝损伤早期血清标志物之一；丙氨酸及乙酰乙酸（与三羧酸循环能量代谢相关）和N-乙酰谷氨酸（与氧化应激相关）可作为黄药子和山豆根致肝损伤的早期尿液标志物之一。