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脊髓损伤再生修复是当今神经科学的重大难题和研究热点,干细胞治疗具有良好的应用前景。通过神经干细胞增殖分化成为神经元,重建神经通路,达到修复损伤功能的目的。深入探讨神经干细胞向运动神经元的定向分化机制,对脊髓损伤后运动功能修复的研究具有重要的意义。微小FRNA (microRNA, miRNA)是生物体内源长度约为20-23个核苷酸的非编码小RNA,通过调控蛋白质的表达谱来调控细胞分化、胚胎发育等一系列重要生命活动的进程。近年来,miRNA在干细胞及其分化中的作用开始受到关注。神经干细胞向运动神经元分化的过程,是神经干细胞特性蛋白表达的降低或消失和运动神经元特性蛋白表达增加或获得的过程。探讨和研究神经干细胞向运动神经元分化的过程中miRNA调控蛋白质的作用通路,需要了解神经干细胞与运动神经元各自的特性蛋白的表达情况。基于以上认识,本文检测了神经干细胞与运动神经元间的miRNA差异表达谱,筛选鉴定了运动神经元分化的关键miRNAs,整合蛋白质组谱、生物信息学分析,建立了关键miRNA调控特定蛋白的分子网络,为诱导神经干细胞向运动神经元分化方案的设计及分化因素的筛选提供依据,并为研究分子间相互作用的机制提供了线索。本课题进行的具体实验及结果如下：实验一：胚胎大鼠脊髓源性神经干细胞与运动神经元的培养及纯化。以免疫磁珠法分离纯化运动神经元,提高了运动神经元培养的纯度；在提取运动神经元的同时,将剩余的细胞悬液采用神经球形成的方法获得神经干细胞,建立了胚胎大鼠脊髓源性神经干细胞与运动神经元的平行培养。实验二：脊髓源性神经干细胞与运动神经元的miRNA表达谱的研究。运用基于Real-time PCR原理的高特异性的TaqMan低密度阵列(TaqMan low-density array, TLDA)技术,比较了脊髓源性神经干细胞与运动神经元的miRNA表达谱,鉴定了在运动神经元中上调(高表达)的60个miRNAs和下调(低表达)的35个miRNAs信息；利用生物信息学方法,对差异rniRNAs的基因簇、转录因子调控进行了研究,在运动神经元中高表达和低表达的miRNAs各发现5个基因簇,预测了差异miRNAs的转录因子结合位点及保守性；利用Ingenuity pathways analysis (IPA)库分析了差异miRNAs的相互作用网络,建立了由3个功能单元分网络组成的miRNA网络。实验三：脊髓源性神经干细胞与运动神经元差异蛋白表达的研究。利用蛋白质组学平台,比较分析脊髓源性神经干细胞与运动神经元差异蛋白的表达。结果发现,在获得的87个蛋白点中,共鉴定了67个蛋白点,22个蛋白点在运动神经元高表达,45个蛋白点在运动神经元低表达。进一步总结分析得出,19种蛋白在运动神经元高表达,24种蛋白在运动神经元低表达。对其中三种代表性的差异蛋白ALDOC、STMN1、YWHAG验证结果显示,与蛋白质组学结果一致；数据库检索和分析,总结了差异蛋白参与的功能和生物过程；利用IPA库分析了差异蛋白的相互作用网络,建立了由3个功能单元分网络组成的蛋白网络。实验四：miRNA调控蛋白质的分子网络的建立。首先,利用miRNA靶基因预测程序对差异miRNAs调控的靶基因进行了预测分析；整合蛋白质组数据、生物信息学预测数据,在运动神经元中高表达和低表达的miRNAs分别确立了31对和30对miRNA-蛋白质调控组合；利用IPA库分析了miRNA调控蛋白质的分子网络,建立了由3个功能单元分网络组成的分子调控网络。结论：1.本课题利用miRNA表达谱检测技术、差异蛋白质学技术及生物信息学方法,筛选和分析了脊髓源性神经干细胞与运动神经元间的差异miRNAs和差异蛋白质；整合miRNA表达谱、蛋白质谱及生物信息学数据,建立了运动神经元差异miRNA调控蛋白质的分子网络。2.通过遗传修饰的方法,在神经干细胞中增强和/或降低某个关键miRNA,可以启动相关的miRNA-蛋白质调控通路,促进神经干细胞定向诱导分化为运动神经元。