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目的 维甲酸类对于体内的各种生理过程起着重要的作用，在体内的合成过程中需要许多酶的参与。其中辅酶Ⅱ-依赖性视黄醇脱氢／还原酶(NADP(H)-dependent retinol dehydrogenase／reducrase，NRDR)是黄东阳等于1997年从兔肝中发现并纯化的一种新的催化视黄醇脱氢／还原的酶，参与维甲酸合成的第一步反应。NRDR活性远大于迄今所报道的胞液的乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase，ADH)和微粒体内的短链脱氢／还原酶(short-chain dehydrogenase／reductase，SDR)类。现人、小鼠、兔NRDR cDNA已被克隆并在GenBank登录(登录号分别为[AB045131][AB045132][AB045133])，但尚无相关的论文发表。本研究根据已知的人、小鼠、兔的NRDR基因保守序列，设计合成特异引物，应用cDNA末端快速扩增技术(rapidly amplify cDNA ends，RACE)法，成功地克隆了牛的NRDR基因并在GenBank登录(登录号为AF487454)，并对该基因序列进行了分析。为进一步研究NRDR酶蛋白的功能及维甲酸的合成奠定了基础。 方法和结果 1．总RNA的提取和cDNA文库的获得 用TriZOI试剂提取总RNA，获总RNA约为100Og，RNA纯度采用紫外分光光度计测定OD值，OD260亿80值为二．84－2刀。逆转录使用TaKaRa的 Reverse TranscriPtase XL（AMV）试剂盒，以OligO dT为引物获得CDNA文库。 2．gi物合成及NRDR cDNA部分片段的扩增 采用Jellyfish软件，根据人J鼠及兔NRDR保守序列的一致性，设计一对引物，PCR扩增得到部分CDNA序列，经测序得到294hP的部分片段。 3．RACE法克隆 3．13”RACE法克隆 根据TaKaRa公司（大连广”RACE试剂盒中的说明进行操作。以已获得的 294hp的部分 NRDR片段为模板，设计 F引物J引物为3”RACE试剂盒中提供的 3”site AdaPer umer，PCR扩增经测序得到1200hp片段。 3．2 5”RACE法克隆 根据TaKaRa公司（大连广”RACE试剂盒中的说明进行操作。以已获得的294hP的部分NRDR片段为模板，设计5”磷酸化RT引物进行逆转录，获取单链CDNA完成第一步反应；再降解杂环 RNA；接着进行连接反应一形成单链环状 CDNA或串联体。设计两对引物，最后进行巢式PCR反应，扩增结果得到400hp和200hp的片段，经测序鉴定200hp为所需的片段。 4．牛肝的NRDR基因全长CDNA的确定及序列分析 将重组与PGEM－T载体的5”－Nested RACE产物200hp和 3”RACE产物 1200hp进行双向测序，拼接一条 1266hp的全长 cDNA序列。利用 NCBI提供的开放阅读框架kPen readingrme，ORF）进行开放阅读框架的判定，从第24到806碱基为完整的阅读框，全长为783、碱基序列，编码260个氨基酸。确认编码区的起始密码子位于24hP，终止密码子位于806hP；5”端的非翻译 ·2·区为二一23 hP；3”端的非翻译区为807－1266hP；多聚腺昔酸（oyA）信号 aaaaa是在 1232－1237hP。其 cDNA序列通过BLAST服务器进行查询与人J鼠、兔、大鼠和猪的CDNA序列显示出80％以上的一致性，证明此基因为牛的NRDR CDNA序列。GenBank数据库查询结果证实为一个新基因（GenBank登录号为AF487454）。 5。蛋白质的功能位点分析 牛肝 NmR基因编码 260个氨基酸，其等电点为 8．6，分子量为27．3 kDa。其氨基酸序列与人＊鼠、兔、大鼠和猪的氨基酸序列比较显示有 75％以上的一致性。用 PROSITE数据库分析牛肝NRDR的功能位点，发现含有天冬氨酸N一端糖基化位点、蛋白激酶Chrotein kinase C，PKC）磷酸化位点、酪蛋白激酶11（Casein hi－nase 11，CKZ）磷酸化位点、短链脱氢／还原酶瞩DR）家族标记及在C一末端有过氧化氢酶体的 C一末端靶向信号（perokisomal targe－ting signal，PfSI）序列 SHL。 6．结构功能域确定 用SMART软件服务器分析牛的NRDR蛋白质结构功能域，发现在13－256含有一个典型的adh－shorthha00106）结构域。 7．蛋白质序列多重对齐分析 用＊）软件进行NRDR蛋白质序列的多重对齐。结果发现，牛 NRDR的氨基酸含有 SDR家族两个保守的模序（TAXXXGXG）与（YXXSK）。 8．牛NRDR基因组织表达图谱分析 Tizol试剂提取各组织总RNA，在编码区内设计一对引物进行RT－PCR反应，结果显示该基因在肝、肾、心、肺、胃、肠组织有表达。 ·3· 讨 论 NRDR是参与维甲酸合成的第一步反应的酶。推导的NRDR氨基酸含有 SDR两个保守模序和 SDR家族结构域及 SDR家族标记，牛的 NRDR属于 SDR家族的新成员。并在其氨基酸的 C一末端含有PISI，推导此NRDR存在过氧化物酶体内。但当初NRDR是黄东阳等从兔肝的胞液里纯化的，所以对于NRDR是否存在过氧化物酶体内还有待于进一步证实。如NRDR确实存在过氧化物酶体内，视黄醛就需从过氧化物酶体内进人胞液合成维甲酸，这种运输对于维甲酸合成的传统通路还应是一个补充。这也是过氧化物酶体内?