香菇多糖(Lentinan)能显著提高人体抗氧化能力,具有抗肿瘤、抗癌、增强免疫力等功效。硒是人体必需的微量元素,可参与调控含硒酶的活性并提高机体抗氧化能力。从理论角度,多糖的硒化修饰能够增强多糖的抗氧化活性,提高其保健及药用价值。然而,关于香菇多糖的硒化修饰、硒化后的结构及其抗氧化能力等科学问题迄今仍没有研究报道。慢性胰腺炎(chronic pancreatitis,CP)是一种由氧化应激引起的持续性和不可逆性疾病,它的发生发展与肠道菌群关系密切。报道指出,适当补充抗氧化剂可以改善胰腺损伤的程度,减缓CP进程。因此,以硒化香菇多糖作为新型抗氧化剂,对其延缓CP进程及对肠道菌群的调节机制进行研究十分必要。本研究采用化学修饰法成功获得了硒化香菇多糖;运用物理化学方法结合光谱技术对硒化香菇多糖的结构进行表征。采用二乙基二硫代氨基甲酸盐(diethyldithiocarbamate,DDC)腹腔注射法建立小鼠CP模型,利用高通量测序技术研究硒化香菇多糖对CP小鼠肠道菌群结构及组成的影响,结合胰腺组织病理学变化、抗氧化试验来揭示硒化香菇多糖对减缓CP小鼠胰腺损伤的作用机制。本研究可为丰富多糖化合物的结构类型及筛选高活性多糖提供理论依据。此外,CP小鼠肠道菌群结构及组成的研究可为CP的早期预警及预防提供新的思路与方法。本研究主要的结果如下:(1)采用超声辅助热水浸提法提取香菇多糖。以香菇多糖得率为检测指标,选取液料比、提取温度、提取时间和超声时间4个因素进行单因素试验。在单因素基础上对香菇多糖的提取条件进行正交优化。正交试验结果表明,4个因素中影响香菇多糖得率的主次顺序为:浸提温度>液料比>超声时间>浸提时间。香菇多糖最佳提取条件:浸提温度75℃、超声时间30min、浸提时间3h、液料比25:1,在此条件下香菇多糖得率为8.07±0.13%。(2)采用硝酸-亚硒酸钠法硒化修饰香菇多糖。以硒结合率为检测指标,选取香菇多糖添加量、亚硒酸钠添加量、反应液pH、硒化温度4个因素进行单因素试验。在单因素基础上运用正交试验方法获得香菇多糖的最佳硒化条件,即香菇多糖添加量1.00 g,反应液pH4.50,反应温度70℃,亚硒酸钠添加量1.50g,在此条件下香菇多糖硒结合率可达3.85±0.05%。正交试验结果表明,4个因素中影响香菇多糖硒结合率的主次顺序为:反应液pH>亚硒酸钠添加量>反应温度>香菇多糖添加量。(3)利用DEAE-52纤维素层析柱与Sephadex G-200层析柱对香菇多糖和硒化香菇多糖进行分级纯化,分别得到组分L2-1和SL2-1。L2-1和SL2-1均易溶于水,硒化修饰增强了 L2-1在水中的溶解性;两者均不溶于乙醇、丙酮、乙醚等有机溶剂。碘-碘化钾反应、氯化铁反应、硫酸-咔唑反应试验显示,L2-1和SL2-1中不含淀粉、糊精、多酚类物质和糖醛酸。L2-1和SL2-1中多糖纯度分别为93.27%和92.01%;硒含量分别为0.55 μg/g和0.32 mg/g。(4)分子量结果表明硒化后香菇多糖的分子量变小,L2-1和SL2-1的分子量分别为2.30×105D和2.04×105D。单糖组成分析结果显示硒化修饰没有改变单糖的种类,但单糖的摩尔比发生了改变。L2-1和SL2-1中甘露糖、葡萄糖和半乳糖的摩尔比分别为11.17:1.30:1.00和11.25:1.64:1.00。紫外光谱及物相分析结果显示,硒化香菇多糖分子中存在Se=O基团。红外光谱 1039.02 cm-1、751.27 cm-1 和 607.54 cm-1位置上分别出现了 O-Se-O、Se=O和Se-O-C的特征吸收峰。扫描电镜-能谱仪分析显示硒化后香菇多糖表面结构发生明显变化,呈现出“鱼鳞状”形态。核磁共振分析发现硒化修饰没有改变香菇多糖中糖残基的构型。在硒化过程中甘露糖C-3位和葡萄糖C-6(C-OH)发生了取代反应。以上结果证实香菇多糖成功被硒化修饰。此外,硒化修饰后未改变其三螺旋结构。(5)体外抗氧化试验表明,L2-1与SL2-1具有较强的抗氧化能力,硒化修饰明显增强了香菇多糖的抗氧化能力,其终止自由基链式反应的作用机制是通过提供电子或氢原子清除超氧阴离子自由基、清除DPPH自由基、羟自由基和还原Fe3+,从而达到抗氧化目的。(6)通过胰腺组织病理学观察,与未硒化香菇多糖相比,硒化香菇多糖明显地改善了CP小鼠胰腺的损伤程度,增加了小鼠的体重及胰腺重量。体内抗氧化试验显示,与L2-1相比,SL2-1显著增强了小鼠体内超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的活性,抑制了胰腺脂质过氧化反应,降低了羟脯氨酸(Hyp)及血清中肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)和淀粉酶(AMY)的水平。(7)高通量测序分析表明,在小鼠体内硒化香菇多糖通过调节肠道菌群结构及组成来减缓氧化应激引起的CP。在门水平上,DDC的诱导导致厚壁菌门(Firrmicutes)数量明显提高;在属水平上,DDC的诱导抑制了小鼠肠道中的一些有益菌如乳酸杆菌属(Lactobacillu)、拟杆菌属(Bacteroides)、罗斯氏菌属(Roseburia)等的生长,促进了Alistipes、紫单胞菌属(Parabacteroides)、Incertae Sedis、瘤胃菌属(Ruminococcus)和幽门螺旋菌属(Helicobacter)的增殖。香菇多糖与硒化香菇多糖组均改变了 CP小鼠肠道菌群的组成,提高了 CP小鼠肠道菌群多样性。与香菇多糖组相比,SL2-1明显提高了拟杆菌门(Bacteroidetes)的相对丰度,降低了厚壁菌门(Firmicutes)的比例;在属水平上,硒化香菇多糖明显促进了乳酸杆菌属(Lactobacillus)、拟杆菌属(Bacteroides)、普氏菌属(Prevotella)、罗斯氏菌属(Roseburia)等的生长,显著地抑制了Alistipes 紫单胞菌属(Parabacteroides)、瘤胃菌属(Ruminococcus)、幽门螺旋菌属(Helicobacter)的增殖。此外,本研究发现硒化香菇多糖组中乳酸杆菌科的数量高于香菇多糖组,却低于亚硒酸钠组,这可能与硒的形态有关。