硝化作用是土壤中重要的生物化学过程,包括氨氧化过程和亚硝化过程,其中氨氧化过程是限速步骤。因此,对硝化作用的研究主要集中在氨氧化过程。氨氧化过程是微生物主导的生物过程,最早研究指出氨氧化过程由氨氧化细菌完成,氨氧化古菌的发现打破了仅由氨氧化细菌完成硝化作用的传统的观念,氨氧化古菌的发现对于完善全球氮循环有重要的作用。研究不同生态系统中氨氧化古菌和氨氧化细菌,至今也还不能明确其在生态系统中究竟是功能冗余还是竞争导致生态位分异,也不能明确影响氨氧化细菌和氨氧化古菌在氨氧化过程中相对贡献率的环境因子。不同生态系统中氨氧化细菌和氨氧化古菌丰度、群落结构和相对贡献率的研究,对于氨氧化过程有重要意义。其中影响氨氧化作用的环境因子有多种,如:土壤类型、温度、水分、氧气含量和pH、铵态氮含量等。其中pH和铵态氮的含量是两个最关键的因子。紫色土是土壤学科中具有特殊地位的土壤之一,主要分布在中国的亚热带地区,以四川盆地为主,在我国农业生产中占有十分重要的地位。按照pH和碳酸盐含量分为酸性、中性和石灰性紫色土。土壤pH是影响土壤硝化作用的因素之一,不仅会对土壤硝化作用的进程产生影响,而且还会对硝化微生物的数量和群落结构产生影响。本实验选取采自重庆永川的酸性紫色土(pH=5.3)和中性紫色土(pH=7.2)以及四川盐亭的石灰性紫色土(pH=8.5),采用稳定性同位素标记技术进行培养实验。每种土样共设有三种处理,包括13CO2标记处理、12CO2对照处理和C2H2+13CO2对照处理。土壤样品在28℃恒温培养箱中培养56天,每周加入100mg/kgN以及相应体积的气体。培养结束后,对培养0天和培养56天的样品进行分析测定,测定pH、铵态氮、硝态氮;实时荧光定量PCR法测定AOA和AOB amoA功能基因的丰度;克隆文库方法测定AOA和AOB的群落结构;Miseq测序方法测定总的微生物。结果如下:经过56天的培养,三种紫色土C2H2+13CO2处理硝态氮含量与培养初期相比均没有变化,说明三种紫色土氨氧化作用都是化能自养微生物完成;中性紫色土12CO2和13CO2处理硝态氮含量分别为536.2、472.9mg/kg,与培养初期12.7mg/kg相比,明显升高,发生了强烈的硝化作用,酸性紫色土12CO2和13CO2处理硝态氮含量分别为5.2和4.5mg/kg,与培养初期6.1mg/kg相比,没有明显变化;石灰性紫色土12CO2和13CO2处理硝态氮含量分别为5.3和4.0mg/kg,与培养初期0.6mg/kg相比,有略微的增加,与中性紫色土相比,变化幅度较小,硝化作用几乎没有进行。三种紫色土经过56天的培养,各处理氨氧化古菌的数量均有不同程度的减小,中性紫色土各处理氨氧化细菌和氨氧化古菌的拷贝数均远大于酸性紫色土和石灰性紫色土各处理,说明氨氧化微生物适宜在中性环境下生长。从NO3--N和NH4+-N含量的变化只能知道中性紫色土有硝化作用发生,从氨氧化细菌和氨氧化古菌的丰度变化可以说明部分氨氧化微生物在起作用,仍需要进一步检验是哪种氨氧化微生物发挥作用。对中性紫色土13CO2标记处理和12CO2对照处理总DNA进行Cscl超高速密度梯度离心,将离心液体分为15层,进行纯化,通过普通PCR扩增,结合凝胶电泳,得出初步结论,再对每层进行实时荧光定量PCR,发现中性紫色土AOA和AOB同时被标记,但是标记程度不深,在中性紫色土中AOA和AOB共同驱动氨氧化过程。采用克隆文库的方法对中性紫色土各处理样品构建系统发育树,培养初期与56天13CO2培养处理AOA发挥活性的均属于Group1.1b,AOB均属于Nitrosospira cluster 3。采用Miseq测序对三种紫色土微生物群落结构进行分析,用shannon值表示测序序列物种的多样性,中性紫色土shannon值>石灰性紫色土shannon值>酸性紫色土shannon,说明中性紫色土各处理土壤样品菌群多样性>石灰性紫色土各处理土壤样品菌群多样性>酸性紫色土各处理土壤样品菌群多样性。稀释曲线说明测序数据量是否合理,在0.97相似性水平下,三种紫色土各处理土壤样品稀释曲线均趋于平坦,说明测序数据量合格。各处理土壤样品中都检测到了Proteobacteria(变形菌门)、Acidobacteria(酸杆菌门)、Firmicutes(厚壁菌门)、Chloroflexi(绿弯菌门)、Actinobacteria(放线菌)、Bacteroidetes(拟杆菌)和Gemmatimonadetes(芽单胞菌门),在中性紫色土中检测到Nitrospirae(硝化螺旋菌门),其中变形菌门在三种紫色土中都大约占有20%的比例。三种紫色土在加入尿素经过56天培养后微生物种类的变化以及比例变化情况不同,酸性紫色土和石灰性紫色土在加入尿素经过56天培养后13C标记处理和乙炔抑制处理变化幅度相同,而中性紫色土13C标记处理和乙炔抑制处理变化幅度不同,13C标记处理变化幅度大于乙炔抑制处理。三种紫色土各处理中氨氧化微生物均属于Nitrospira(硝化螺菌属)和Nitrosospira(亚硝化螺菌属)。通过对中性紫色土13CO2标记处理和12CO2对照处理总DNA分层样品进行Miseq测序,挑选出其中的硝化微生物序列,发现AOB和NOB占总测序数的最大比例均出现在重层,对氨氧化微生物的标记程度进行验证,和定量PCR的结果相同。本研究阐述了三种pH紫色土硝化作用和氨氧化微生物的差异,探明中性紫色土氨氧化作用的主要推动者。由实验结果得出以下结论:(1)三种pH紫色土氨氧化微生物的丰度不同,氨氧化微生物适宜在中性环境下生长。(2)中性紫色土中氨氧化过程由氨氧化细菌和氨氧化古菌共同推动。(3)中性紫色土氨氧化古菌均属于Group1.1b,氨氧化细菌均属于Nitrosospira cluster3