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开发微生物油脂是未来发展生物柴油产业的新途径。然而微生物油脂的成分较为复杂,难以满足生物柴油对单不饱和脂肪酸的要求。△1 2脂肪酸脱饱和酶(又称油酸脱氢酶,简称FAD2)是调节生物体内单不饱和脂肪酸向多不饱和脂肪酸转化的关键酶之一,它催化油酸18:1(△9 )脱氢形成亚油酸18:2(△9,12)。近年来随着分子生物学技术的发展,反义FAD2基因在油料作物脂肪酸调控基因工程中得到广泛应用,获得了油酸含量很高的转基因玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、花生(Arachis hypogaea)、油菜(Brassica campestris)等。然而,该技术在产油真菌中的应用尚未见报道,这是一个全新的研究方向,具有重要的现实意义。根癌农杆菌介导法(AtMT)较之传统的遗传转化方法,具有操作简便、遗传稳定、转化率高、重复性好等优点。本实验室已从木本油料树种千年桐(Vernicia montana)中克隆到油酸脱氢酶基因(VeFAD2),我们设想运用AtMT法将来自于植物的反义VeFAD2基因导入产油真菌中,期望通过基因工程手段调控真菌的脂肪酸代谢,获得高油酸、低亚油酸含量的转基因工程真菌。本研究通过抗生素浓度试验:挑选产油真菌少根根霉(Rhizopus arrhizus)和深黄被孢霉(Mortierella isabellina)作为遗传转化的受体材料;确定卡那霉素筛选剂的作用浓度为300-500 ug/ml;选择头孢呋辛钠作为抑菌剂,作用浓度为150ug/ml。采用冻融法构建了含有VeFAD2基因反义表达载体pBI121-fad2的根癌农杆菌AGL-1工程菌株。用农杆菌介导的方法对丝状真菌少根根霉和深黄被嫒?凶?其中对少根根霉的转化获得阳性转化子,从保存的12株转化子中,随机选取5个,进行PCR-Southern杂交鉴定,均出现杂交信号,表明目的基因已整合到这些菌株的基因组中。转基因菌株在非选择培养基中连续转接5代后还能在选择培养基中正常生长,其抗卡那霉素性状依然可以稳定遗传。本文对根癌农杆菌菌株类型、农杆菌初始菌液量、共培养时间、乙酰丁香酮(acetosyingone,AS)作用时期与作用浓度等影响少根根霉遗传转化的几个关键因子进行研究,结果表明:根癌农杆菌菌株EHA105和AGL-1都适用于少根根霉的转化,且后者的转化效率高于前者;适宜的农杆菌初始菌液量为50-100ul;共培养时间为24h,既能获得转化子又降低了假阳性率;对于农杆菌EHA105,在共培养阶段不能缺少AS的诱导,在预培养时期加入200 umol/L AS、共培养时期增加AS浓度到400umol/L及以上都有利于提高转化效率。另外,本文还改进了试验操作中的共培养时期涂板环节和转化子筛选培养环节:通过稀释菌液的方法控制涂板量,解决了农杆菌污染问题;对筛选培养基加入方式的改进,获得了2个少根根霉单克隆阳性转化子。本文通过根癌农杆菌介导法实现了反义VeFAD2基因对产油真菌少根根霉的遗传转化并获得转基因菌株;对转化条件的优化,构建了一套经由根癌农杆菌介导的植物基因在少根根霉中高效转化的体系,同时也为将该体系应用于其它产油真菌的转化提供参考。