利用人工锌指核酸酶（ZFN）进行基因敲除,简单高效,成为了近年来的研究热点。尽管利用ZFN进行基因敲除简单高效,但是,在目前成功的实例中,仍然需要复杂的胚胎操作和显微注射,一般实验室仍然无条件进行。为了解决这个问题,我们拟建立更加简单高效的利用ZFN的基因敲除技术,我们将这种技术称作为睾丸介导人工锌指核酸酶（TM-ZFN）的基因敲除技术。跨膜蛋白18（TMEM18）是一个与肥胖相关的基因,但其功能不尚不为人知,笔者以TMEM18为靶建立ZFN,敲除TMEM18,研究TMEM18的功能。笔者首先构建了一个用于构建人工锌指核酸酶的通用载体质粒p2NfokIT,在这个质粒中,含有T2A连接的两个核定位肽和核酸内切酶fokI的酶切结构域相连的组件（NLS-fokI）,这在两NLS和fokI之间分别含有两个酶切位点,只需将锌指蛋白的DNA结合结构域部分插入其中,即可得到表达锌指核酸酶的质粒。笔者对TMEM18基因进行搜索,在第三个外显子找到了较为理想的ZFN打靶位点,设计了识别该位点的锌指和两个锌指蛋白DNA结合结构域,其中一个锌指蛋白的DNA结合结构域采用Sp1C骨架,另一个采用Zif268骨架。利用融合PCR的方法,分别通过6条引物合成了两条锌指蛋白的DNA结合结构域。将两个锌指蛋白的DNA结合结构域连接到构建人工锌指核酸酶的通用载体中,得到了表达人工锌指核酸酶的质粒p2NfokIT/2ZF。笔者采用报告基因的方法,对设计的人工锌核酸酶进行了活性评估,构建了一个在eGFP中含有终止密码子和TMEM18中打靶位点的eGFP突变质粒pMeGFP。和一个在eGFP中没有启始密码子和其上游没有启动子的eGFP供体质粒pddeGFP。将pMeGFP、pddeGFP和表达ZFN的质粒p2NfokIT/2ZF共转染HEK293细胞,48小时后,检测细胞荧光,结果表明,ZFN能有效的在预期位点上打靶。蛋白质分析表明,TMEM18在小鼠生精细胞、精母细胞和成熟精子内表达量较高。将含10μg ZFN的脂质体Lipfectin200混合物转染液100μl分别注射到小鼠两侧睾丸（每侧50μl）。3天后,对睾丸和附睾中成熟精子进行蛋白质分析,结果表明,TMEM18的蛋白质水平在成熟精子中显著降低,在睾丸中的没有显著变化。打靶位点的PCR产物的酶切分析表明,ZFN在部分成熟精子中的基因组DNA的打靶位点上实现了切断。这些结果说明睾丸注射ZFN能高效的敲除精子中的基因。为以后利用睾丸介导ZFN建立基因敲除的小鼠打下了基础。笔者的初步研究表明,胚胎水平上敲除TMEM18可能影响受精卵的着床。我们分析了ZFN转染的原代小鼠骨骼肌细胞中与受精卵着床有关的β-catenin和磷酸化的Akt的蛋白质水平,结果表明,TMEM18敲除后,β-catenin和磷酸化的Akt的蛋白质水平显著降低,说明TMEM18敲除,导致Wnt信号通路和胰岛素信号通路受损。这些可能与影响受精卵的着床有关。这一结果,为我们继续研究TMEM18的功能提供了新的方向。